ERK途径参与未受精蚕卵的孤雌激活

翁宏飚，牛宝龙

（浙江省农业科学研究院 蚕桑所，浙江 杭州 310021）

自从上世纪三十年代发现蚕卵在一定条件下，可少量发生孤雌发育的现象以来，人们开展了大量的家蚕未受精卵的孤雌诱导实验，通过优化诱导条件，筛选易发品系，建立起高效的家蚕孤雌生殖体系［1～3］。在国内，对家蚕种质库中的保存品种进行筛选，并通过连续多代的选择，建立起全球最大的家蚕孤雌生殖种质资源库，培育的孤雌生殖家蚕品种进入生产实用［4］。在开展家蚕孤雌生殖应用研究的同时，家蚕孤雌生殖机理的研究也在不断探索中。通过家蚕孤雌生殖发育蚕卵的细胞学研究，发现46℃、18 min的热激处理，可以使阻滞于第一次减数分裂的染色体结构解体，同源染色体不再分离，直接进入第二次减数分裂模式，染色单体相互分离，从而使得子代染色体组保持与亲代相同的2 n［2］。日本学者研究发现，在家蚕嵌合体突变品系的孤雌生殖中，同时存在极体自受精和不完全减数分裂两种机制，而在可自发发生孤雌生殖的品系M90中，其孤雌生殖发育则主要为不完全减数分裂机制［5］。孤雌生殖品系的转录组学研究结果显示，许多调控途径参与了家蚕热激诱导的孤雌生殖发育［6］。

卵母细胞成熟调控是一个复杂的多因子调节过程。在脊椎动物中，卵细胞分裂阻滞于第2次成熟分裂中期，等待受精活化［7］。而在无脊椎动物中，卵母细胞发育过程中的第2次分裂阻滞发生在第1次成熟分裂中期［8］。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activat⁃ed protein kinase cascade，MAPK）信号通路是细胞间信号传递的重要通路，参与细胞形态、细胞分化及细胞周期的各个环节［9］。MAPK在卵细胞减数分裂的MⅠ期/MⅡ期转变过程中保持活性，是调节卵母细胞减数分裂的中枢［10］。已有大量研究发现，MAPK信号途径参与脊椎动物卵细胞的人工活化过程［11～12］，在卵受精或孤雌活化后，MAPK发生去磷酸化而失活，分裂阻滞解除，细胞恢复分裂。在对无脊椎动物叶蜂的研究中发现，MAPK信号途径参与叶蜂的孤雌生殖发育，蜂卵经人工孤雌激活，分裂阻滞解除后，随着发育时间的延长，磷酸化修饰的MAPK和MEK含量逐渐下降，激活后50 min，已检测不到磷酸化修饰的激酶［13］。定量比较MAPK信号通路基因在有性生殖品系与孤雌生殖品系间的表达差异，结果显示信号通路基因的表达，在两个品系间存在显著性差异，暗示MAPK信号通路可能参与了家蚕孤雌生殖发育［14］。

MAPK信号通路的核心是几种蛋白激酶的顺序磷酸化激活，MEK是催化MAPK磷酸化修饰的直接分子［15］。U0126是MEK1/2的高效特异性抑制剂。对叶蜂卵的研究中发现，以抑制剂U0126处理蜂卵，可以降低卵内MAPK的磷酸化水平，解除卵细胞分裂阻滞，诱导恢复分裂，达到孤雌诱导的效果［13］。家蚕孤雌生殖首先需要通过热激处理，解除细胞分裂阻滞，恢复细胞分裂过程，而后在各种机制的维护下完成胚胎发育。本研究以不同浓度的U0126注射羽化前不同时期的雌蛹，羽化后收集未受精卵，46℃、18 min热激诱导孤雌生殖，调查未受精卵的转色率、孵化率指标，结果显示U0126可以促进未受精卵孤雌生殖激活后早期胚胎的发育，提高蚕卵的转色率。

1 材料与方法

1.1 材料和主要试剂

家蚕孤雌生殖品系无14是原种54A，经连续多代热激（46℃，18 min）诱导筛选出的PL品系；多化性品系Nastari为浙江省农科院蚕桑所保存蚕品种。

抑制剂U0126购自Selleck公司（美国），溶剂DMSO购自上海生工，未受精卵热激用水浴、恒温恒湿箱购自上海博讯公司；protoCOL自动菌落计数仪（synbiosis，Cambridge，UK）为农科院质量标准研究所仪器。

1.2 方法

将U0126粉剂溶于DMSO，配制成10 mmol母液，于-20℃分管保存。使用时用PBS缓冲液稀释成工作液备用。

熟蚕上蔟结茧后，削茧鉴蛹，雌蛹常规保护至复眼着色。取10 g消特灵粉剂溶于2 L蒸馏水中，配制成蛹体消毒液。将复眼着色雌蛹浸入消毒液中1 min，捞出后放在干净的吸水纸上晾干保护。在羽化前2 d，按每蛹20 μL的注射量，给雌蛹注射U0126工作液并常规保护至羽化，每个浓度注射10颗雌蛹。蚕卵孤雌生殖诱导及蚕卵保护参照［4］方法进行。由于无14品系孤雌生殖发育良好，蚕卵发育调查时，随机称取0.1克蚕卵，统计良卵率和孵化率；多化性品系Nastari蚕卵发育初期不着色，在孵化前2～3 d开始转色。考虑到Nastari孤雌生殖蚕卵的发育较有性生殖蚕卵慢，因此在有性生殖蚕卵孵化后一周，随机称取0.15 g蚕卵，均匀摊于8 mm平皿中，用菌落计数仪统计转色蚕卵数，并计算单位重量的转色蚕卵数量，用于统计分析。仪器的设置为：曝光时间：40 ms；排除小颗粒：小于0.1 mm。每个实验均设3个重复。采用SPSS软件进行差异显著性分析。

图1 U0126处理后孤雌生殖品系无14良卵率和孵化率Figure 1 Good egg rate and hatching rateof Wu14with U0126treating

2 结果与分析

2.1 品系无14的孤雌生殖激活

2017年春蚕期，无14上蔟结茧后，于6月3日注射雌蛹，6月5日羽化，常规取卵，孤雌生殖诱导，蚕卵保护及入库冷藏，8月15出库调查并开始催青。蚕卵调查结果如图1。

抑制剂U0126处理孤雌生殖品系无14后，高浓度组的良卵率指标与对照组的相仿，但低浓度组及有机溶剂DMSO组的良卵率显著下降。蚕卵孵化率指标，对照组与高浓度组无统计差别，而低浓度组及溶剂组则极显著降低。

2.2 品系Nistari的孤雌生殖激活

2017年秋蚕期，于9月13日注射处理Nistari雌蛹，9月15日羽化，收集未受精卵并进行孤雌生殖热激诱导，因Nastari品系孤雌生殖孵化率极低，而且蚕卵早期不着色，为判断发育进度，设置有性生殖蚕卵对照，同步蚕卵保护及催青，有性生殖蚕卵孵化后一周，用自动菌落计数仪调查孤雌生殖的发生情况。结果如图2。

虽然Nistari经U0126处理后，各处理组均无孵化，但各组的蚕卵转色情况并不相同。20 μmol/L处理组蚕卵转色极显著优于其他处理组；10 μmol/L处理组极显著好于5 μmol/L组和对照组；5 μmol/L组和对照组的单位卵重转色卵数则极显著高于溶剂对照组和1 μmol/L处理组。

3 讨论

目前家蚕孤雌生殖发育的调查指标主要有蚕卵着色率（孤雌生殖发生率）及催青后孵化率。普通蚕品种在受精或孤雌生殖激活后，细胞恢复分裂并开始胚胎发育约24 h～28 h，卵内浆膜形成后转为固有色，再经10 d左右催青而后孵化。现有蚕品种经热激诱导后，有较高的未受精卵着色率，平均蚕卵着色率为50%左右［4，16-17］，部分蚕卵能发育到转青期和点青期，但极少孵化。本实验所用的Nistari是多化性热带白卵蚕品种，蚕卵激活开始发育后，早期蚕卵不转色，催青第7 d-8 d左右，蚕卵出现少量着色，在有性生殖蚕卵孵化后5 d内，孤雌生殖蚕卵颜色仍在变化，7 d后蚕卵颜色变化不大。因此，实验中在有性生殖蚕卵孵化后第7 d，调查孤雌生殖蚕卵的转色情况，作为Nistari孤雌生殖发育的指标。

图2 U0126处理后，每克孤雌生殖蚕卵中的着色卵数Figure 2 Amount of coloring eggs in each gram of parthenogenesis eggs with U0126 treating

本实验中，经高、中浓度抑制剂处理后，Nistari品系的转色卵比例极显著高于对照。已有的研究显示，家蚕的遗腹卵率大约在10%～15%左右［18］，虽然遗腹卵不等同于未成熟卵，但不能排除大部分遗腹卵属于未成熟卵，孤雌生殖诱导后不能着色而成为不良卵。考虑到用于孤雌生殖诱导的未受精卵为解剖卵，包含了全部未成熟卵，因此抑制剂处理后无14良卵率的提高虽未达显著水平，但可以确定U0126处理可以使得更多蚕卵被激活而进入胚胎发育，或有利于孤雌生殖蚕卵的发育。Nistari低浓度组和溶剂组的转色卵指标极显著低于对照组，以及无14低浓度组和溶剂组的良卵率显著低于对照组，可能是由于DMSO的细胞毒性，抑制了胚胎发育造成的。而且DMSO的细胞毒性在无14孵化率上也有体现：在低浓度组和溶剂组中，无14的孵化率极显著地低于对照组。另外，Nistari品系的不滞育和卵发育后期转色的特点，是合适的家蚕孤雌生殖研究材料。

显微观察孤雌生殖转色卵，可见蚕卵呈现块状或带状着色斑，而不是有性生殖蚕卵的完全着色形式，因此在统计着色卵指标时，可能因统计人员的不同，而出现不同的统计结果，影响结果分析。本研究中，利用自动菌落计数仪，通过设置合适的参数，可以客观、高效地统计着色卵数，因而该系统可以在家蚕孤雌生殖研究中应用。

［1］ ASTAUROV B L.Artificial parthenogenesis and experi⁃mental polyploidy in silkworm［J］.The Journal of Sericul⁃tural Science of Japan，1967，36：277-285.

［2］ STRUNNIKOV V A.Control over Reproduction，Sex，and Heterosis of the silkworm［M］.London：Harwood Academ⁃ic Publishers，1995.

［3］ KLYMENKO V V.Parhenogenesis and cloning in the silkwormBombyx mori L：Problem and prospects［J］.J.In⁃sectBiotech.Sericol，2001，70：155-165.

［4］ 王永强，徐孟奎，何秀玲，等.家蚕现行品种孤雌生殖的研究［J］.蚕业科学，2001，27（1）：20-23.

［5］ KUSAKABE T，KIDO K，KITA K，et al.Analysis of artifi⁃cial andspontaneousparthenogenetic development in mosa⁃ic mutationsand the parthenogenetic strain of Bombyx mo⁃ri［J］.Invertebrate Reproduction&Development，2004，45（2）：101-108.

［6］ LIU P，WANG Y，DU X，et al.Transcriptome Analysis of Thermal Parthenogenesis of the Domesticated Silkworm［J］.2015，PLOS ONE DOI：10.1371/journal.pone.0135215.

［7］ MCCARTER J，BARTLETT B，DANG T，et al.On the control of oocyte meiotic maturation and ovulation in Cae⁃norhabditis elegans［J］.Developmental Biology，1999，205（1）：111-128.

［8］ MASUI Y.Meiotic arrest in animal oocytes［M］.San Di⁃ego：Academic Press，1985.

［9］ SUN Q Y，BREITBRTH，SCHATTEN H.Role of the MAPK cascade in mammalian germ cells［J］.Reproduc⁃tion，Fertility，and Development，1999，11（8）：443-450.

［10］DUPRÉ A，HACCARD O，JESSUS C.Mos in the Oocyte：How to Use MAPK Independently of Growth Factors and Transcription to Control Meiotic Divisions［J］.Journal of Signal Transduction，2011，2011（2090-1739）：350412.

［11］FAN H Y，SUN Q Y.Involvement of mitogen-activated protein kinase cascade during oocyte maturation and fer⁃tilization in mammals［J］.Biology of Reproduction，2004，70（3）：535-547.

［12］吴晓慧，李卫平，狄文.卵母细胞减数分裂转变过程的调控机制［J］.生殖与避孕，2009，29（11）：741-745.

［13］DAISUKE S Y，KAZUNORI T，MEGUMI S，et al.Involve⁃ment of Mos–MEK–MAPK pathway in cytostatic factor（CSF） arrest in eggs of the parthenogenetic insect，Athalia rosae［J］.Mechanisms of development，2008，125：996-1008.

［14］翁宏飚，刘培刚，牛宝龙，等.MAPK信号通路参与热激诱导家蚕未受精卵发生孤雌生殖发育的研究［J］.蚕业科学，2016，42（4）：0598-0605.

［15］范衡宇，佟超，陈大元，等.MAPK信号通路在卵母细胞减数分裂中的作用［J］.科学通报，2002，47（9）：650-656.

［16］潘少茜，李宝瑜，廖琼香，等.家蚕资源品种孤雌生殖力的研究［J］.广东农业科学，1996，1996（3）：40-42.

［17］白兴荣，廖鹏飞，邵榆岚，等.云南省部分家蚕品种资源的孤雌生殖发生率调查［J］.蚕业科学，2012，38（5）：0938-0941.

［18］严会超，林健荣，钟生泉，等.家蚕遗腹卵的研究-Ⅰ.环境条件与家蚕遗腹卵发生的关系［J］.广东蚕业，1997，31（2）：22-26.