核桃油贮藏过程抗氧化能力的研究

彭星星 ，乔茜华 ，张红云 ，高海军 ，高敬铭 ，戴冠苹 ，秦祎芳

(1.河南省粮油饲料产品质量监督检验中心，河南 郑州 450000；2.国家电网公司运行分公司郑州管理处，河南 郑州 450000)

核桃为世界四大干果之一。我国也是核桃的原产地之一，栽培面积和产量均居世界之首。现今核桃已然成为了我国核桃主产区乡村经济的支柱产业之一，在推动农业结构调整、提高农民收入和保障我国食用油供给安全等方面起到了重要的作用。祖国医学指出，核桃性温、味甘、无毒，有健胃、补血、润肺、养神等成效[1]。核桃具有很高的营养价值[2-5]，核桃含油量约为65%，被称为“树上的油库”，核桃油脂肪酸组成主要是亚油酸、油酸和亚麻酸等不饱和脂肪酸,含量高达约为90%[6-7]，对于降低胆固醇防治冠心病、动脉硬化和心肌梗塞等疾病有很大作用[8-10]。核桃油中富含黄酮类物质[11-12],还含有神经酸、鳕油酸、EPA、DHA、角鲨烯、褪黑素、黄酮、胡萝卜素等微量营养成分[13]，能够防治动脉粥样硬化[14]、具有抗氧化[15]等功效。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

试验用核桃油(冷榨法，无任何添加剂)取自陕西海源生态农业有限公司，在试验前进行密封贮藏，防止其氧化变质。

1.1.2 试剂

1，1-二苯基-2-苦肼基DPPH，Sigma公司；维生素C，邻苯三酚，三羟甲基氨基甲浣(Tris)，水杨酸，硫酸亚铁，氢氧化钠，98%浓硫酸，双氧水，盐酸，无水乙醇，试验用水为蒸馏水。

1.2 仪器与设备

EL-204型电子天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；720紫外分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；TDL-5低速离心机，赛默飞世尔科技公司；恒温水浴锅，太仓市试验设备厂；pH计。

1.3 核桃油抗氧化能力的测定

1.3.1 核桃油清除DPPH·自由基能力试验

DPPH·溶于乙酸乙酯中呈现出紫色，在波长515 nm处有最大吸收值，并且浓度和吸光度为线性关系，物质的抗氧化能力可以由物质对DPPH·的清除能力来表示。主要通过紫外分光光度法进行测定。

(1)称取0.000 39 g DPPH，用乙酸乙酯定容至100 mL，得到浓度为1×10-4mol/L的DPPH溶液，低温放置，待用；

(2)在10 mL的试管中分别加入含2 mL未氧化核桃油、氧化10 d核桃油、氧化20 d核桃油、氧化30 d核桃油、VC的乙酸乙酯溶液，浓度分别对应为0.03 g/mL、0.06 g/mL、0.09 g/mL、 0.12 g/mL、0.15 g/mL。之后再依次加入DPPH反应液4 mL，摇匀，放置暗处反应30 min，反应结束后，在515 nm波长处测定吸光度值；

(3)对照组为2 mL样品加入4 mL乙酸乙酯溶液；空白组为2 mL乙酸乙酯溶液加入4 mLDPPH反应液。以乙酸乙酯溶液作为参比，测定其吸光度，记录下吸光度值，由此计算DPPH.的清除率。

注：Ai—2 mL样品溶液+4mLDPPH溶液测定的吸光度值。

Ai0—2 mL样品溶液+4mL乙酸乙酯溶液测定的吸光度值。

A0—2 mL乙酸乙酯+4mLDPPH溶液测定的吸光度值。

1.3.2 核桃油清除羟基自由基能力试验

Fenton反应是用二价铁离子作为催化体系，用双氧水作为氧化剂的氧化反应体系，在化学反应过程中可以产生羟基自由基，依据对水杨酸-乙醇反应体系的氧化情况，确定待测样品能否对羟基自由基产生清除效果。在化学反应过程中，二价铁离子被其氧化成三价铁离子可能发生混凝反应从而生成沉淀。

(1)制备硫酸亚铁溶液(6 mmol/L)：准确称取0.083 4 g七水合硫酸亚铁用少量蒸馏水溶解，然后转移至50 mL 容量瓶中精确定容，获得6 mmol/L的硫酸亚铁溶液；

(2)制备水杨酸-乙醇体系(6 mmol/L)：准确称取0.041 4 g水杨酸溶于少量无水乙醇中，然后用无水乙醇溶液准确定容为50 mL(100 mL)，得到6 mmol/L水杨酸-乙醇体系；

(3)制备0.1%的双氧水溶液：用微量移液器准确量取含30%浓度双氧水溶液166.7 μL转移至50 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，得到0.1%的双氧水溶液。

在10 mL的试管中分别加入1 mL 6mmol/L的水杨酸-乙醇溶液和1 mL 6mmol/L硫酸亚铁溶液，之后分别加入1mL的样品溶液(用无水乙醇定容)，浓度分别为0.03 、0.06、0.09、 0.12、0.15 g/mL，最后加入0.8 mL双氧水溶液，使反应开始，摇匀，将其放置于37 °C水浴锅中反应30 min，水浴反应完毕之后在3500 r/min速度下离心10 min，然后取上清液在510 nm波长处测定其吸光度值，以无水乙醇取代双氧水作为对照组，以无水乙醇取代样品溶液作为空白组。

注：Ai—为样品的吸光度值。

Ai0—以无水乙醇代替双氧水对照组的吸光度值。

A0—以无水乙醇代替样品空白的吸光度值。

1.3.3 核桃油清除超氧阴离子自由基能力试验

邻苯三酚在弱碱性环境下(Tris-HCl溶液提供)能够使自身发生氧化分解反应，生成超氧阴离子自由基。在反应进行过程中，超氧阴离子自由基不断地增多，在这一过程中生成带有颜色的中间产物，从而使反应溶液在波长420 nm下吸光度值在一段时间内随时间变化而成线性增长关系。所以，在这一时间段内，吸光度的变化能够反应样品对超氧阴离子自由基的抑制能力。

(1)制备邻苯三酚溶液(30 mmol/L)：准确称取0.189 2 g邻苯三酚，用10 mmol/L的盐酸溶液溶解，定容于50 mL容量瓶中，此溶液需临场配制；

(2)制备10 mmol/L HCl：加0.86 m L的浓盐酸至1 000 mL的水中。

(3)Tris-HCl溶液(pH=8.2)：配制1L 0.05 M(50 mmol/L)Tris-HCl溶液，称量7.88 g Tris-HCl置于1 L烧杯中，加入约800 mL左右的去离子水，用玻璃棒充分搅拌溶解后加入浓盐酸调节至所需要的pH值，然后将溶液定容至1 L，经高温高压灭菌后，在室温下保存。

(4)制备样品溶液(1.0 mg/mL)：分别称取0.025 g未氧化核桃油、氧化10 d核桃油、氧化20 d核桃油、氧化30 d核桃油、维生素C用无水乙醇定容至25 mL容量瓶中，得到1.0 mg/mL的样品乙醇溶液和维生素C溶液。

具体实验方法：分别称取样品未氧化核桃油、氧化10 d核桃油、氧化20 d核桃油、氧化30 d核桃油乙醇溶液、维生素C溶液(1.0 mg/mL)1.0mL，放置于10 mL试管中，之后加入pH为8.2的Tris-HCl溶液5.0 mL，邻苯三酚溶液50 μL，迅速混匀，以蒸馏水为空白每30 s测定波长420 nm处的吸光度值。

注：Ai—(1 mL样品溶液+5 mLTris-HCl溶液+50 μL邻苯三酚溶液)的吸光值

A0—(1 mL蒸馏水+5 mLTris-HCl溶液+50 μL邻苯三酚溶液)的吸光值

2 结果与分析

2.1 核桃油清除DPPH·自由基能力的研究

不同氧化天数的核桃油(Walnut Oil，下表中简称WO)样品对DPPH·的清除能力如图1所示：

图1 不同氧化天数的核桃油对DPPH·的清除率

表1 不同氧化天数核桃油对DPPH·抑制的回归曲线

样品线性回归方程IC50/(mg/mL)R2未氧化WOy=0.448x+15.8676.210.992氧化10dWOy=0.451x-0.989113.060.995氧化20dWOy=0.262x+3.350178.050.998氧化30dWOy=0.258x-0.650196.320.991VCy=0.333x+47.57.510.993

经比较发现，随着浓度水平的增加，不同氧化天数的核桃油对DPPH·的抑制率也随之增加，并且氧化时间越短，核桃油的清除效果越好，76.21mg/mL质量浓度未氧化核桃油清除DPPH·自由基的能力为50%，相当于7.51 mg/mL质量浓度 VC对DPPH·清除自由基的能力，相当于113.06 mg/mL质量浓度氧化10 d核桃油清除DPPH·的能力，相当于178.05 mg/mL质量浓度氧化20 d核桃油清除DPPH·的能力，相当于196.32 mg/mL质量浓度氧化30 d核桃油清除DPPH·的能力。此结论与孟阿会[17]的结果相一致，这可能是由于随着氧化时间的增长，核桃油中的天然抗氧化成分如黄酮、生育酚等的含量也急剧降低，核桃油的抗氧化能力也逐渐减弱，清除DPPH·的能力也逐渐减低[20]。

2.2 核桃油清除羟基自由基能力的研究

不同氧化天数的核桃油样品对·OH的清除能力如图2所示：

图2 氧化不同天数核桃油对·OH的清除率

表2 不同氧化天数核桃油对·OH抑制的回归曲线

样品线性回归方程IC50/(mg/mL)R2未氧化WOy=0.469x+9.36286.650.991氧化10dWOy=0.349x+7.562121.600.991氧化20dWOy=0.249x+7.769169.600.990氧化30dWOy=0.236x+4.962190.840.991VCy=0.326x+49.51.530.992

经比较发现，86.65 mg/mL质量浓度未氧化核桃油清除·OH自由基的能力为50%，相当于1.53 mg/mL质量浓度 VC对OH·清除自由基的能力，相当于121.60 mg/mL质量浓度氧化10 d核桃油对·OH清除自由基的能力，相当于169.60 mg/mL质量浓度氧化20 d核桃油清除·OH的能力，相当于190.84 mg/mL质量浓度氧化30 d核桃油清除·OH的能力。随着浓度水平的增加，不同氧化天数核桃油对·OH的抑制率增加，并且氧化时间越短，核桃油的清除效果越好。这可能是由于随着氧化时间的增长，核桃油中的天然抗氧化成分如植物甾醇等的含量也急剧降低，核桃油的抗氧化能力也逐渐减弱[21]。

2.3 核桃油清除超氧阴离子自由基能力的研究

不同氧化天数的核桃油样品及维生素C对超氧阴离子自由基的清除能力如图3所示：

图3 核桃油对超氧阴离子的清除率

样品平均抑制率/%最大抑制率/%未氧化WO55.5390.84氧化10dWO38.4360.64氧化20dWO22.6043.84氧化30dWO15.4333.77VC56.1969.00

3 结论

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