化学发光免疫分析在调味食品原料安全检测中的应用

刘享享，兰文军

(齐鲁工业大学(山东省科学院) 生物工程学院， 济南 250353)

化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay，CLIA)是将灵敏度较高的化学发光反应和特异性结合较强的免疫反应相联合产生的一种分析方法，其最初的理论基础来源是放射免疫分析[1]。化学发光根据其本身具有荧光的特征，在无激发光存在的情况下仍可以产生荧光信号，从而避免了荧光收集时激发光中散射光的影响。除了具有高特异性、高灵敏度以及宽线性检测范围的显著优点外，化学发光免疫分析所需要的检测仪器简单、操作方法方便、不具有放射性污染且易实现自动化,节省时间等一系列的优势[2-6]，逐渐得到各科学领域的广泛关注和研究应用，尤其是在调味食品原料安全的快速检测中得到越来越多的应用。

1 化学发光免疫分析的基本原理

化学发光免疫分析，是将免疫反应和化学发光检测相结合而产生的[7]。免疫反应部分主要是抗原或抗体与报道标记物结合后，通过特异性免疫反应，产生抗原-抗体复合物的过程。化学发光检测指报道标记物与相关催化剂的反应,首先形成一个中间物质，处于一种激发态,从激发态到达基态的中间物质会释放出一系列光子或电子，最后通过专门的信号收集仪器计算出光量子的产出率[8]。

2 化学发光免疫分析方法分类

化学发光免疫分析的分类标准存在着较大的差异，目前主要依据各种方法本身借助的报道标记物质的差异，分为采用具有发光能力的化学发光剂对抗原或抗体直接进行标记的化学发光免疫分析(直接法)；另一类是将化学发光剂作为酶促反应底物的化学发光酶免疫分析；以及在电极表面进行的电子得失的电化学发光反应称为电化学发光免疫分析。

2.1 化学发光免疫分析(直接法)

化学发光免疫分析(Chemiluminescent Immunoassay,CLIA)又称为直接法检测，利用具有发光功能的化学类物质和抗原或抗体直接反应，随后在一系列的生理生化反应中达到检测目的的免疫分析方法。常见的报道标记物有吖啶脂，但吖啶脂由于热稳定性不好，目前常用吖啶脂衍生物作为报道标记物。吖啶脂衍生物具有发光能力的技术原理为：在含H2O2的碱性溶液中，吖啶脂衍生物作为报道标记物发生由激发态到基态的转变，产生一定的光子而被检测器捕获。吖啶脂衍生物标记的化学发光免疫分析发光系统简便、检测速度快，无需催化剂的加入，且标记效率高，本底低，但此类闪光型化学发光对仪器要求较高。

2.2 化学发光酶免疫分析

化学发光酶免疫分析(Chemiluminescent Enzyme Immunoassay, CLEIA)是在酶类物质作为报道标记物的情况下，与加入的抗原或抗体产生带有酶标记的复合物，然后与底物反应而产生化学发光，在专门仪器中收集发光信号。辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)和碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, ALP)是目前使用比较普遍的标记酶，它们具有各自特定的发光底物。

鲁米诺及其衍生物作为HRP的主要发光底物，利用HRP与抗原或抗体发生免疫反应产生复合物，将鲁米诺或其衍生物质在碱性环境H2O2参与下，生成激发态中间体，当其回到基态时产生光子，其中HRP的量也影响信号强度。金茂俊等[9]认为此传统化学发光体系为几秒内瞬时闪光，产生的光强度相对较小，从而会导致测量时难度大，如果加入化学发光增强剂可显著提高发光信号,稳定发光的时间明显延长,从而增强此反应体系的检测灵敏性和准确度。1，2-二氧环己烷作为目前ALP的发光底物，应用较为普遍。Bronstein等[10]发现的3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐(AMPPD)-ALP发光体系是该化学发光体系中主要选择的体系。这一化学发光反应体系的特点是反应速度快，发光时间相对较长，对检测仪器要求稍低，短时间可提供检测结果。

2.3 电化学发光免疫分析

电化学发光反应与免疫分析方法相互融合而产生的一类更加方便、快捷的检测分析方法称为电化学发光免疫分析方法(Electrochemiluminescent Immunoassay,ECLIA)。该方法是通过电极表面所产生的电子的得失而发生的一系列反应，而其他化学发光是通过化合物之间彼此作用激发发光反应的进行。三联吡啶钌[Ru(byp)32+]为电化学发光免疫分析常用的发光底物,主要通过三丙胺(TPA)的激发促使发光反应的产生。Ru(byp)32+和TPA在阳极同时失去电子，发生氧化反应。其基本原理为：二价的[Ru(byp)32+]被氧化成三价的[Ru(byp)33+]，同时TPA也被氧化成了阳离子自由基(TPA+*)，TPA+*通过自身质子的释放变成了不稳定的TPA*，并将一个电子传递给三价的[Ru(byp)33+]而使之变成激发态的二价[Ru(byp)32+*]；二价的[Ru(byp)32+*]衰减释放出光子，再次回到基态形式的[Ru(byp)32+]。通过这种方式可以在短时间内发出稳定的光，且在电极表面反复进行，发光强度不断增强。

3 化学发光免疫分析(CLIA)在调味食品原料安全检测中的应用

中国对于调味食品的探索和食用有着悠久的历史，可以说调味食品在我们的日常生活中起着重要的使用价值。伴随着化工合成添加物质在食品中的发展，调味品生产行业也蓬勃发展。但是，调味食品在快速发展的同时，也存在着不少问题，尤其是原料安全检测方面。比如，酿造类和鲜菜类调味品中原料的农药残留，水产类调味品中抗生素的不当使用等，严重损害着消费者的利益和身体健康。因此，选用快速、高效的检测技术是至关重要的。

3.1 调味食品原料中药物残留检测

调味食品中的药物残留最主要的原因是在原料加工时未进行严格有效的把控，从而产生一系列的食品安全问题，所以对于调味食品原料的检测尤为重要。传统调味食品原料中农药残留的检测方法主要有色谱、质谱以及高效液相等，但是操作步骤复杂，仪器昂贵，对实验条件要求也很高。而化学发光免疫分析操作步骤简单、性价比高、特异性好等优点，可以弥补其他检测方法的不足。

食醋是一种酸味调味品，随着工艺的不断改进，饮料型食醋是目前比较受消费者欢迎的产品。而对于原料(如各种水果以及水源)的监控也是重中之重。2017年，Ding等[11]将化学发光酶免疫分析方法进行了改进，实现了对食醋原料苹果和梨中烟碱类农药氯噻啉的快速检测，其线性范围为0.13～5.84 ng/mL，半定量检测抑制中浓度(IC50)为0.86 ng/mL。与建立的噬菌体酶联免疫分析方法相比，其方法检测的线性范围更宽，灵敏度更高，与高效液相色谱结果显示良好的相关性。2012年，Jin等[12]利用化学发光酶免疫分析方法实现了环境中三唑磷农药的检测,检测范围为0.04～5 ng/mL,对水和土壤的添加回收率分别为117.2%和122.0%。

在一些风味饮品中也需要一些调味食品，从而起到提升口感的作用。比如奶精可以使饮品口感更加顺滑，奶精的原料可以从动物乳制品浓缩而成，而这些原料中残存的兽药可以危害到消费者的身心健康。随着化学发光免疫分析方法高灵敏、可多种药物同时检测的优点显现,一些奶制品兽药的检测也得到进一步拓展和深化。Luo等[13]利用化学发光酶免疫分析方法，在2016年成功检测出牛奶中新霉素的含量，最低检测限为9.4 μg/kg，灵敏度为2.4 ng/mL，其中添加样标本平均回收率为88.5%～105.4%，与液相色谱-质谱法进行比较具有较高的相关系数。2014年，Tao等[14]基于化学发光免疫分析方法，实现了牛奶中氯霉素和盐酸克仑特罗的双重检测，牛奶样品中氯霉素和盐酸克仑特罗的灵敏度分别为0.00501，0.0128 μg/L，结果明显优于商业的酶联免疫分析试剂盒。

3.2 调味食品原料中违禁添加物检测

除药物残留外，调味食品原料中还含有一些危害人体健康的添加物，如俗称“瘦肉精”的盐酸克仑特罗，主要作为饲料中常用的调味剂。消费者食用了残留瘦肉精的肉就有可能产生一系列的不良反应比如头疼、四肢麻木、心悸等。目前化学发光免疫分析方法在克伦特罗、沙丁胺醇、吗啡等违禁添加物检测中表现出较高的灵敏度，该方法的应用价值也将会得到显著提升。

2013年，Yao等[15]基于电化学发光免疫分析方法，建立了克伦特罗的快速检测，检测限为0.02 ng/mL，线性检测范围为0.05～1000 ng/mL。2015年，Cai等[16]利用电化学发光免疫分析方法，建立了沙丁胺醇的免疫分析检测，检测线性变化范围为0.05～500 ng/mL，检测下限为0.017 ng/mL。2012年，杜海平[17]建立了金磁微粒和化学发光免疫分析相结合的吗啡的免疫检测方法，结果显示IC50为63 ng/mL。此方法可以快速地检测食品中是否含有违禁调味食品罂粟壳。

3.3 调味食品原料中生物毒素的检测

调味食品原料中天然存在的毒素以及一些毒素的次级代谢产物，比如含有生物毒素的豆类或水稻等被加工成调味食品后，严重影响人体健康。为了更加安全、快捷、方便、有效地检测调味食品原料中的生物毒素，建立了化学发光免疫分析检测。米酒的酿造过程中，霉变水稻中生物毒素的检测至关重要。2013年，Yu等[18]建立了黄曲霉毒素B1的化学发光酶免疫分析方法，该方法线性范围为0.003～0.03 ng/mL，检测限为0.0015 ng/mL，对水稻和绿豆的添加回收率分别为90%～104%和102%～117%。2015年，Kim等[19]基于化学发光免疫分析方法，建立了水稻中赭曲霉素A的检测方法，检测效果比酶联免疫分析方法高7.3倍。

为了更好地节省时间以及化学试剂，化学发光免疫分析方法可实现多种生物毒素的同时检测，传统的酶联免疫检测暂时是无法实现的。2016年，Wang等[20]基于硅胶-水凝胶光子晶体微球技术，建立了黄曲霉毒素B1、伏马菌素B2和赭曲霉毒素A多重真菌毒素的化学发光酶免疫分析检测方法，3种毒素的线性检测范围分别为0.0001～1，0.001～10，0.0001～1 ng/mL，在水稻、玉米和小麦中的回收率分别为(74.96±5.82)%～(104.87±5.77)%。

3.4 调味食品原料中病原微生物检测

病原微生物的存在可以引起调味食品原料的霉变和腐败，进而对人体的健康产生影响，现阶段检测病原微生物的方法存在检测周期长、方法繁琐、需要大量的手工操作等不足，而化学发光免疫分析方法可以起到对以上不足之处的弥补。目前，基于化学发光免疫分析方法, 实现了对大肠杆菌的检测,检测结果均表现出较高的准确度和检测灵敏度, 可显著降低检测时间, 因此，化学发光免疫分析方法在调味食品原料病原微生物检测领域存在必然的发展趋势。2008年，Wolter等[21]利用化学发光免疫分析方法，建立了水样中大肠杆菌O157：H7、鼠伤寒沙门氏菌和嗜肺军团菌的免疫检测，这3种菌的检测限分别为3×103,3×106，1×105个/mL。2006年，郭小英等[22]基于化学发光磁酶免疫法建立了大肠杆菌的检测方法，与人工计数培养检测相比，相关系数达到0.9807,这对于调味食品原料中大肠杆菌污染的快速检测是非常有必要的。

4 展望

近年来，食品安全事件不断出现，而调味食品又是日常生活中不能缺少的，调味食品安全问题也越来越受到人们的关注。因此，建立统一的调味食品原料安全检测体系，对于调味食品原料快速统一的检测方法和完善的质量控制措施是当务之急的工作。

由于化学发光免疫分析较强的检测专一性、较高的灵敏度、仪器使用和操作相对简单、可同时进行多重检测等优点,在调味食品原料安全检测方面得到了良好的应用。目前对于该方法的应用主要还是在抗原、抗体和半抗原的免疫测定中,这势必在调味食品原料安全检测领域中提供一种超痕量的免疫检测手段。总体而言，与传统的酶联免疫分析方法相比，该方法检测灵敏度更高，对于分子量较小的化合物也能进行检测，并且可以实现多种有害物质的残留检测，而传统的酶联免疫分析在进行多种成分检测时较困难。但是，金茂俊等发现目前的化学标记物发光值尚不十分稳定，从而造成批内批间的变异系数会高于酶联免疫分析方法[23]。所以，化学发光免疫分析依然存在一些在试验中亟待解决的困扰，比如(1)寻找更多更加稳定的化学发光标记物；(2)对目前使用较多的标记物质稳定性的改进和改造；(3)探索与其他新型技术联合应用，实现多组分同时快速有效的检测，节约时间成本；(4)如何提高电化学发光检测的应用稳定性。随着科技的不断发展，相信在不久的将来化学发光免疫分析方法一定能在调味食品原料安全检测中不断展现其优越性。

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