羔羊诱导卵泡发育及其应用的研究进展

张 通，张家新

（内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古自治区动物遗传育种与繁殖重点实验室，内蒙古呼和浩特 010018）

幼畜体外胚胎移植（Juvenile In Vitro Embryo Transfer，JIVET）技术是一项重要的繁殖生物技术，其利用幼畜卵巢上储备的大量卵母细胞生产体外胚胎，具有发挥优秀母畜的繁殖潜能、缩短繁育世代间隔，提高畜群遗传进展的优势。目前，许多研究机构和企业利用JIVET技术繁育获得了健康后代，但羔羊诱导卵泡发育效果不稳定、卵母细胞体外发育能力差、胚胎产出效率低等问题限制了羊JIVET技术在生产实践中的利用效率。因此，本文对羊JIVET技术的原理、研究进展以及影响JIVET技术效率的因素加以综述，以期提高JIVET技术的利用效率，促进其应用。

1 JIVET技术的原理与最新研究进展

自然情况下，每只成年母羊不经激素诱导处理仅可获得2～8枚卵母细胞，经激素诱导处理后的每只成年羊可获得10～20枚卵母细胞。然而，幼龄羔羊卵巢上有腔卵泡数量储备多，下丘脑-垂体-卵巢调控轴机能尚未发育健全，不具备调控卵泡发育成熟排卵功能，一般在4～8周龄诱导羔羊卵泡超数发育。Kennedy等[1]观察发现，自然情况下在母羊妊娠135 d左右，绵羊胎儿卵巢上开始出现有腔卵泡，出生后有腔卵泡的数目随羔羊日龄的增长而逐渐增多，在出生后4～8周龄卵泡数达到高峰。随着初情期的到来，卵泡数量随之减少并维持相对稳定。Tassell等[2]研究发现，2周龄时绵羊卵巢上生长卵泡数量最多，4周龄时总卵泡数达到峰值，而且大多数卵泡的直径小于1.4 mm；4周龄羔羊卵巢上开始发生卵泡闭锁的迹象，8～10周龄羔羊卵巢上卵泡闭锁的数量逐渐增多。由上可知，出生后2～8周龄是羔羊卵泡生长发育的旺盛阶段。

卵泡对促性腺激素反应能力的强弱决定了卵泡是继续生长发育还是闭锁退化[3]。卵泡生长发育过程一般要经历促性腺激素不依赖期和依赖期2个时期。腔前卵泡的生长发育即原始卵泡生长的启动和初始卵泡的生长并不完全依赖于促性腺激素，主要靠生长因子的调节。有腔卵泡的生长发育则完全依赖于促卵泡素（FSH）和促黄体素（LH）的协同作用，并且主要受促性腺激素内分泌的调控[4-5]。因为幼龄羔羊卵巢内分泌机制并未发育健全，且对促性腺激素刺激敏感。目前，利用外源促性腺素诱导4～8周龄羔羊卵泡超数发育，平均每只供体羔羊可获得80～100枚卵母细胞[6-8]。尽管外源激素诱导羔羊卵泡超数发育获得了丰富的卵源，但羔羊卵母细胞体外发育能力差、受胎率低仍然是普遍问题。

迄今为止，很多研究者致力于研究成年动物与幼龄动物卵母细胞在细胞形态[9-10]、基因表达代谢[11-12]和发育能力[13-14]方面的差异以及整个胚胎体外生产培养体系[15-16]。因此，提高供体羔羊选择效率，优化外源激素诱导卵泡超数发育的方案，增加供体羔羊卵母细胞的数量，同时提高羔羊卵母细胞质量和体外发育能力，才能将羊JIVET技术更好地服务于羊产业。

2 影响JIVET 技术效率的内因

2.1 供体羔羊的选择 选择合适的供体羔羊是羔羊诱导卵泡超数发育的重要环节之一[17]，激素敏感的供体羔羊在促性腺激素作用下会产生大量卵泡并产生具有较好发育能力的卵母细胞。年龄、体重、出生类型和对激素刺激的敏感性是影响JIVET技术稳定性的内在因素[18]。Ptak等[19-20]发现，羔羊卵巢对激素反应的不稳定性仍然是影响JIVET 技术效率的主要问题之一，大约20%的羔羊供体对激素处理没有反应或反应差，而且卵母细胞发育到囊胚的发育率很大程度上依赖于供体羔羊，每只供体羔羊提供的胚胎数量在0～55枚[18]。Armstrong等[21]提出，理想的供体羔羊年龄在4～6周龄，该时期供体羔羊卵巢对激素的敏感性最好。O'Brien等[22]表明，激素诱导3～6周龄羔羊获得卵母细胞的体外发育能力显著高于16～24周龄未接受激素诱导的羔羊。此外，Morton等[23]观察比较了激素刺激3～4周龄和6～7周龄的羔羊，发现羔羊子宫重量、卵巢重量、卵巢上卵泡数目以及卵母细胞数回收率在2组之间没有显著差异，而3～4周龄羔羊卵母细胞的囊胚发育率（20.4%）显著低于6～7周龄羔羊（27.9%）。

供体羔羊激素处理前的体重常常作为选择供体羔羊的指标。Morton等[24]发现，供体羔羊激素处理前的生长速度和体重与羔羊卵巢增重和卵泡数目无关。然而，Valasi等[25]研究表明，如果诱导卵泡的激素刺激方案调整到适宜羔羊体重的剂量，那么羔羊获取的卵母细胞数量和质量都可以大大改善。

Kelly等[17]处理6～8周龄供体羔羊时发现，出生类型也会影响羔羊卵母细胞的发育能力。激素诱导雌性同胞羔羊获得囊胚产出效率显著高于雌雄同胞羔羊。然而，雌雄同胞羔羊的囊胚率（39.5%）与单胎羔羊（34.6%）或三胞胎羔羊（36.5%）没有显著差异。由此来看，雌性同胞作供体羔羊有助于提高JIVET的技术效率。

羔羊卵巢对于激素诱导卵泡超数发育刺激的反应强弱存在个体差异。Morton 等[23]根据3～4周龄羔羊个体对激素刺激反应的强弱分为低反应（小于20个卵泡/卵巢）、中等反应（20～50个卵泡/卵巢）以及高反应（大于100个卵泡/卵巢）3个等级，且3～4周龄和6～7周龄羔羊中，对激素刺激反应差的个体的卵母细胞利用率比中等反应和高反应个体高。但羔羊个体反应能力差的个体囊胚率低[18-19]。此外，为了充分发挥优秀供体羔羊的遗传优势，采用重复的激素诱导刺激能够提高单只羔羊提供的卵母细胞总数，然而供体羔羊超数诱导获得卵母细胞的数量随诱导处理次数的增加而逐渐减少。陈晓勇等[26]对6～8周龄羔羊首次激素诱导处理，时隔3周再次处理获得羔羊卵母细胞的数量极显著低于首次诱导。Valasi等[25]认为，重复诱导卵泡超数发育获得卵母细胞数量下降的主要原因是由于卵巢对激素刺激敏感性降低。

目前仍然没有确切地选择供体羔羊的特效办法，但大多数研究者仍然认为4～8周龄羔羊是诱导卵泡超数发育、获得较好发育能力卵母细胞的理想供体。

2.2 羔羊卵母细胞的发育能力 卵母细胞生长发育的卵泡内环境对卵母细胞获得发育能力具有重要的影响，卵母细胞一旦脱离卵泡内环境，其固有的发育潜能也随之确定。

从表观形态学角度看，与成年羊相比，羔羊诱导卵泡超数发育获得的卵母细胞直径小、颗粒细胞层少、脂滴多。从卵母细胞发育潜力角度看，卵母细胞直径与卵母细胞发育能力息息相关。Anguita等[27]将羔羊卵母细胞按直径分类（小于 110、110～125、125～135 μm 和大于135 μm），结果表明不同直径卵母细胞的体外成熟率分别为0、20.7%、58%和78%，第8天的囊胚率分别为0、0、1.95%和12.5%。Leoni等[13]观察比较了羔羊和成年羊体外成熟24 h的卵母细胞发育能力 ，结果发现羔羊卵母细胞的体外成熟率和受精率（分别为95.1%、66.73%）与成年羊（分别为96.7%、70.62%）没有显著差异，但与成年羊相比，羔羊卵母细胞的异常受精率高、卵裂率和囊胚率较低，但羔羊囊胚的形态、囊胚细胞总数和内细胞数占总细胞数比例与成年羊囊胚没有显著差异[12,30]。卵母细胞体外成熟历经一个多阶段、复杂的调控过程，涉及细胞核成熟、细胞质成熟以及颗粒细胞与卵母细胞的相互作用。羔羊卵母细胞发育能力差很大程度上与卵母细胞细胞核与细胞质成熟不同步有关。Palmerini等[10]观察发现，虽然大多数羔羊卵母细胞体外成熟培养24 h也能达到成年羊卵母细胞形态上的成熟状态，但羔羊卵母细胞核成熟滞后以及细胞质质量差。Kochhar等[9]提出羔羊卵母细胞需要额外2 h体外成熟才能达到成年羊卵母细胞常规体外成熟24 h的成熟状态。此外，羔羊体外胚胎也表现出发育迟缓的现象，如2-细胞[28]、4-细胞[18]、囊胚[28]。相反，Morton等[23]认为，羔羊胚胎发育的速度与成年羊没有差异，造成发育速度差异的原因可能是高剂量FSH处理、不同的培养系统或氧浓度的高低。因此，羔羊卵母细胞发育能力差在很大程度上与其超微结构异常、胞质缺陷、代谢紊乱等导致的核质成熟不同步有关。目前，大多数研究者采用延长羔羊卵母细胞体外成熟时间，进而提高卵母细胞的成熟质量。从基因蛋白水平来看，羔羊卵母细胞全基因组甲基化水平和mRNA储存量都显著低于成年羊，甲基化水平的降低会影响某些印记基因的表达，mRNA储存的贮存不足会影响核质成熟[29-30]。卵丘细胞与卵母细胞之间的联接对于卵母细胞成熟期间营养物质的输送以及蛋白合成至关重要。Ledda等[31]研究发现，羔羊与成年羊卵母细胞成熟促进因子（Mature Promoting Factor，MPF）的形式与活动水平相似，但羔羊卵母细胞成熟培养后的MPF合成量显著低于成年羊，这可能与羔羊卵丘细胞和卵母细胞联接发育不完善有关。此外，Leoni等[13]研究证明，与成年羊相比，羔羊卵母细胞具有较少的线粒体以及特殊的线粒体分布模式。因此，卵母细胞内mRNA和蛋白质的储存以及线粒体活性和分布作为哺乳动物卵母细胞发育能力的决定因素，最终将影响胚胎的品质。运用现代生物信息学技术分析预测调控卵母细胞发育能力的相关基因和关键通路结合体外生产试验，对于正确理解羔羊卵母细胞体外核质成熟机制以及解释羔羊卵母细胞发育能力下降的原因具有重要意义。

3 影响JIVET 技术效率的外因

3.1 供体羔羊的营养 营养不良会影响成年母羊超数排卵的数量和质量[32]。幼龄羔羊的营养依赖于母体。Kelly等[33]研究发现，妊娠期间母羊营养水平的差异直接影响出生后羔羊诱导卵泡超数发育的效果、卵母细胞质量以及囊胚发育率。妊娠期间营养水平高，羔羊诱导卵泡超数发育效果好，胚胎产出率相对也高。Abecia等[34]报道，孕早期营养不良不仅会引起母羊繁殖力和多产性能下降，而且可导致JIVET羔羊诱导卵泡超数发育获得卵母细胞数目的下降。因此，供体羔羊的营养水平与健康状态一定程度上会影响JIVET技术效率。

3.2 超数诱导卵泡发育的季节 成年母羊的超数排卵受繁殖季节的影响，非繁殖季节超排效率较低，繁殖季节超排效率较高。羔羊由于体内的生殖轴并未发育健全，但对激素刺激反应较为敏感，诱导卵泡超数发育不受季节限制。但Gou等[7]用激素诱导处理4～8周龄羔羊，发现夏季和秋季的卵泡生长发育显著优于冬季，而且卵母细胞的发育能力在这3个季节之间存在极显著差异。季节对于JIVET技术效率的影响仍需进一步研究验证。

3.3 激素诱导处理方案的优化 激素处理诱导卵泡超数发育，不仅诱导增加卵泡的生长，引起卵泡细胞和卵泡内环境的生化变化，而且激活了卵母细胞内的生物合成过程。另外，激素还可以刺激颗粒细胞中促性腺素受体的增加[35]。

迄今，关于优化羔羊诱导卵泡超数发育的方案已经进行了大量的研究。基于成年母羊超排方案，研究者开展了羔羊诱导卵泡超数发育方案的探究。Ledda等[36]采用孕酮结合促性腺激素，选择30～40日龄的羔羊进行激素诱导处理，给羔羊阴道埋植海绵栓（体积是成年羊埋栓体积的1/6）6 d，撤栓前36 h一次性分别注射120 IU促性腺激素释放激素（GnRH）和400 IU孕马血清促性腺激素（PMSG），撤栓24 h后采卵，平均每只羔羊获得86.2枚卵母细胞，成熟率为77.9%。Ptak等[18]采用类似的处理方法给1月龄羔羊阴道埋植孕酮栓8 d，从第5、6、7天每天早、晚各注射27 mg FSH，第8天撤栓，平均每只羔羊获得约29枚卵母细胞，成熟率为49.8%，囊胚率为22.9%。Kelly等[6]采用促性腺素法，一次性肌肉注射l60 mg FSH和间隔12 h等量注射4×40 mg FSH，最后一次FSH注射的同时注射400 IU马绒毛膜促性腺激素（eCG），发现分4次等量注射FSH效果优于一次性注射，平均每只供体羔羊获得88枚卵母细胞，卵裂率为77.5%。也有研究发现，羔羊卵母细胞收集之前用GnRH处理，可促进卵母细胞在体内的成熟发育，但不影响卵母细胞的收集数量、形态以及囊胚发育率[37]。目前，大多数研究者采用等量4×40 mg FSH或者6×40 mg FSH处理方案。

总之，激素刺激增加收集卵母细胞的数量以及提高卵母细胞发育能力，但激素诱导羔羊卵泡超数发育的最佳方案以及激素诱导处理对卵母细胞发育能力的机制尚未明确。

3.4 羔羊体外胚胎的培养体系 目前，羔羊胚胎体外生产所涉及的卵母细胞体外成熟、体外受精、受精卵体外培养等过程的培养体系均基于成年羊体外胚胎生产的培养体系。为提高羔羊卵母细胞和胚胎的体外发育能力，许多研究者致力于改善优化体外胚胎培养体系。Bai等[15]在体外成熟液中添加2-巯基乙醇和半胱氨酸并没有提高核成熟或微管构型，但改善了精子解聚并提高了囊胚率。L-左旋肉碱及其衍生物乙酰基-L-肉碱可以将长链脂肪酸转运到线粒体中，通过β-氧化产生ATP向细胞供应能量[38]。Reader等[16]研究发现，在体外成熟液中添加乙酰基-L-肉碱可以用于增加羔羊卵母细胞体外胚胎的囊胚率，但对线粒体的体积、数量以及线粒体DNA的拷贝数没有影响。此外，Catalá等[39]发现，亮甲酚蓝阳性羔羊卵母细胞的发育能力显著高于亮甲酚蓝阴性羔羊卵母细胞；Wang等[40]提出，在体外成熟之前，用13 μmol/L亮甲酚蓝染色羔羊卵母细胞可用于选择有发育能力的羔羊卵母细胞。此外，他们建议使用米力农（Milrinone）可以促进羔羊胚胎的体外发育能力。

目前，尽管在体外培养基中添加抗氧化剂、促生长因子以及抗凋亡剂均能有效提高受精率和胚胎发育效率，但优化改善羔羊卵母细胞体外成熟和胚胎体外培养体系仍有待提高。

4 小 结

目前，国内外JIVET技术领域虽然取得了初步进展，也获得了一定的推广应用，但涉及羔羊卵子发生调控和卵泡发育机理相关机制的研究进展缓慢。随着基因组学、蛋白组学、代谢组学和胚胎生物技术研究的迅猛发展，从各个角度深度解析羔羊卵母细胞与成年羊卵母细胞发育、成熟和代谢的差异，优化JIVET技术激素处理方案和体外培养体系，才能更好地发挥JIVET技术在羊繁育体系中的作用。

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