膝骨关节炎软骨损伤及组织工程学修复

曹 曦 冯 洋 路 通 崔 伟

(广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530001)

膝关节软骨作为胫骨与股骨连结组成部分能减轻关节摩擦和提供缓冲以保证肢体正常活动和稳定负重。膝骨性关节炎中关节软骨退变、软骨下骨赘增生及滑膜炎症等会破坏软骨组织〔1〕，导致关节疼痛、关节交锁征、关节畸形等异常表现，膝关节软骨长期不可逆损伤会使患者丧失关节功能，严重影响患者生活质量。目前针对膝关节软骨早期损害的手术治疗方法包括软骨膜移植及自体骨软骨镶嵌移植成形术等，终期治疗手术为关节置换术〔2〕。但是这些方法存在关节内粘连、感染、移手术失败等缺陷〔3〕。使用软骨组织工程支架、种子细胞和生长因子能够对原生软骨属性进行仿生，提高软骨修复效果。本文对膝骨关节炎软骨损伤及组织工程学修复的研究现状进行综述。

1 膝骨关节炎与软骨损伤

膝关节炎关节软骨损伤的具体机制仍未明确。关节软骨由其唯一的固有细胞软骨细胞和软骨细胞外基质(ECM)共同构成〔4〕。软骨细胞在膝关节骨性关节炎进程中对损伤做出反应，维持组织内稳态，并执行软骨重建。膝骨关节炎条件下的软骨细胞活动信号会发生改变，退变的软骨细胞容易被诱导增殖分化为肥大软骨细胞，由软骨细胞分化而成的肥大软骨细胞会使软骨的生物特性发生变化，软骨应力和维持自身完整性的能力下降会导致软骨在应力条件下遭到侵袭和破坏〔5〕。正常的软骨细胞能够对Ⅱ型胶原蛋白、蛋白多糖和透明质酸的生成和代谢进行调节以维持软骨ECM的基础结构及软骨的生物力学性能。在骨关节炎进程中，软骨细胞会影响软骨ECM大分子物质的代谢和合成〔6〕。软骨ECM合成分解代谢异常会激动关节内环境中的巨噬细胞及其他免疫细胞释放包括肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-6和IL-22等在内的促炎细胞因子，这些促炎细胞因子会通过改变软骨细胞功能加速软骨损伤进程〔7〕。软骨细胞在对IL-1β、TNF-α等促炎细胞因子进行应答时还会释放出如人基质金属蛋白酶(MMP)-13和血管性血友病因子裂解蛋白酶(ADAMTS)-5等大量蛋白酶，而这些蛋白酶会破坏胶原、软骨低聚基质蛋白(COMP)和黏多糖等从而损害软骨正常功能〔8〕。此外，膝关节炎患者软骨下骨成骨细胞(SBOs)也会使软骨细胞表型和功能发生变化，表型改变后的软骨细胞合成可聚蛋白多糖能力下降而软骨ECM特异性酶生产能力会上升，上升的特异性酶与关节炎症及软骨破坏进程密切相关〔9〕。软骨破坏和关节炎发病机制中成纤维样滑膜细胞(FLSs)也发挥着关键作用，受损软骨细胞会通过释放胶原蛋白刺激FLSs分泌MMPs，加剧软骨降解。

总之，膝骨关节炎软骨损伤和软骨细胞及ECM功能障碍密切相关，膝骨关节炎会导致ECM和软骨细胞异常。软骨细胞和ECM异常，各种因素相互作用使软骨更易被磨损，而磨损的软骨也会促使机体释放各种物质加重膝骨关节炎，因此对于对膝关节炎的受损软骨进行修复显得十分重要。

2 软骨组织工程学

模拟原生软骨的结构、成分及信号环境促进软骨再生是软骨组织工程领域的研究重点。软骨损伤修复的组织工程学方法需要通过细胞及生物支架完成，种子细胞通常会被转移至具有软骨ECM特性的生物支架上，生物支架能够模拟ECM微环境为种子细胞存活、增殖及分泌活动提供支持。用于搭载种子细胞的生物支架具有可降解性，生物支架降解后，种子细胞能够进行分化并以吸附方式对软骨的受损部位进行修复，种子细胞的分化需要生长因子诱导和机械刺激完成。此外受损部位也会通过高自导信号释放趋化因子和细胞激素促进修复〔10〕。

2.1种子细胞 虽然目前研究人员对软骨细胞、成纤维细胞、干细胞和转基因细胞等都进行了研究，但是目前软骨修复研究最多还是自体软骨细胞和间充质干细胞(MSCs)。

2.1.1自体软骨细胞 成人的自体软骨细胞的优点为能够合成并分泌ECM、获取方便、免疫排斥风险低等。自体软骨细胞可以从关节软骨、鼻中隔、肋软骨或耳廓软骨中分离获得。研究发现〔11〕，利用如鼻中隔或耳软骨细胞等非关节软骨类软骨细胞作为细胞来源增殖率更高，供区并发症发病率也更低。研究表明〔12〕，骨关节炎衍生的自体软骨细胞也能作为种子细胞用于软骨组织工程。通过自体软骨细胞移植能够改善早期膝骨关节炎患者生活质量和减轻患者的疼痛症状。

2.1.2MSCs MSCs具有增殖潜能良好、组织来源丰富和分化诱导方式多样等优点。MSCs能够通过调节免疫、血管生成、抗凋亡、抗纤维化和抗炎分泌物来发挥其再生作用〔13〕。关节注射MSCs也已被证明对膝骨关节炎损伤软骨具有改善作用，但是MSCs关节注射具有包括细胞成活率有限等局限性〔14〕。MSCs可通过特定因素诱导或刺激分化为成软骨细胞。目前诱导MSCs分化可以通过三维细胞培养、低氧张力和机械刺激等方法完成。三维细胞培养能够使MSCs保持或恢复与软骨细胞相类似的表型〔15〕，三维细胞培养还能够有力地促进MSCs分化。低氧条件下处理MSCs可以促进诱导MSCs生成软骨，还可以防止MSCs肥大化〔16〕，同时缺氧诱导因子(HIFs)能够促进软骨ECM基因的表达〔17〕。

2.2生物支架 通常用于制作软骨组织工程生物支架的材料应具有理化可调性。用于制作支架的生物材料分为天然与人工聚合物两种，其中天然聚合物又可以分为蛋白质或碳水化合物型〔18〕。从生物学角度来说，制作支架的理想生物材料必须具有生物相容性且无毒性，以防止其引发宿主炎性及免疫反应；从结构角度来说，制作生物支架的材料还必须能够为软骨细胞表型的三维培养及保证细胞能够牢固黏附和填充于受损位置提供支持；从组成成分角度来说，生物材料还必须具有通透性，能够允许分子、无机物及生长因子进行扩散，用于制作支架的生物材料通常还应该具备生物可降解性、可注射或刚性结构及可以通过微创方式整合重塑关节软骨〔19〕。

可用于制作生物支架的天然聚合物包括纤维蛋白胶、胶原、蚕丝蛋白、藻酸盐、壳聚糖、透明质酸等，这些天然聚合物制作的生物支架具有良好的降解性、亲水性和细胞黏附性，但机械性能欠佳。制作支架常用的人工聚合物包括聚乳酸(PLA)、PLA-羟基乙酸共聚物(PLGA)和聚己内酯(PCL)等，这些聚合物都具有良好机械性能和可调性，但是可降解性能和生物活性欠佳。天然生物聚合物通常被广泛用于制造水凝胶支架，而高分子聚合物支架通常以人工聚合物为材料〔20〕。但是目前研究人员正致力于将天然聚合物和人工合成物相结合以制作出生物相容性更高、性能更优的生物支架用于软骨修复〔21〕。

2.2.1水凝胶 水凝胶生物支架一直是生物支架制作领域的研究热点。以水凝胶为生物材料制作的组织工程支架具有以下多项优点：具有与软组织相似的特性和性质，能够为封装细胞提供了结构支持；具有良好的溶胀性和润滑性；能够对机械应力进行传导；能够允许其所搭载的细胞保持球形形态，而软骨细胞的表型特征即为球形形态〔22，23〕。水凝胶的这些特性可以维持软骨细胞表型和细胞生长提供稳定的环境。目前还有研究人员将水凝胶和生物打印技术相结合对水凝胶生物特性进行调控，用于软骨结构功能修复研究〔24，25〕。但是水凝胶生物支架还存在如机械强度不理想等一些缺点。因此今后的研究需要材料学家与组织工程及其他相关学科研究人员交叉合作，共同开发力学性能更高、降解速率更好、生物相容性更高的水凝胶支架用于修复软骨损伤。

2.2.2纤维蛋白胶 天然聚合物纤维蛋白胶作为良好黏合剂和止血剂被广泛运用于临床。纤维蛋白胶具有良好的生物相容性且能够促进细胞和ECM相互作用〔26〕。纤维蛋白胶还能够承受较大负荷，能够有效维持其原有形态及大小。纤维蛋白胶还能够促进软骨细胞的增殖和软骨组织ECM生成。在兔子实验生上已表明，使用纤维蛋白胶作为生物支架材料，可以通过控制纤维蛋白原的浓度从而对纤维蛋白胶的降解速率和聚合时间进行调节。纤维蛋白胶也能够通过结合其他聚合物(如聚氨酯等)来调节种子细胞的生物活性和分布状况。

2.2.3壳聚糖 壳聚糖为半晶体聚合物，其结晶程度与脱乙酰程度有关，在体内可通过溶菌酶降解为寡糖。壳聚糖表面具有亲水性，能够促进细胞的增殖、增殖和分化。通过控制冷冻温度和脱乙酰度，壳聚糖能够被制作成孔隙分布良好的生物支架用于软骨骨组织修复〔27〕，这也是壳聚糖最有研究价值的特有表现之一。研究发现〔28〕，使用特殊处理后制作的壳聚糖水凝胶支架，在修复软骨组织时能够使局部形成更多黏多糖和Ⅱ型胶原。

2.2.4蚕丝蛋白 蚕丝蛋白作为天然蛋白聚合物具有以下特征：机械性能可塑性、生物相容性、低免疫原性、限制细菌黏附、生物降解可调性等等。蚕丝蛋白生物支架具有理想的生物活性，能够进细胞黏附和生长。但是天然蚕丝蛋白支架有可能会引起机体免疫反应。有研究人员制作了一种低免疫原性的软骨素蚕丝蛋白支架用于软骨修复，这种支架的在体和体外研究结果都显示这种低免疫原性支架能够用于软骨修复〔29〕。

2.2.5纤维支架和多孔海绵 纤维支架具有机械性能优异、结构可调性高、可降解、无毒、制造简便等优点。纤维支架也会通过其孔隙分布、纤维方向及纤维直径等性质对其所搭载细胞的排列、分布和迁移产生一定影响。纤维支架的机械力学性质和小牛软骨相类似。纤维支架的缺点为脆性差、无诱导作用和可降解性能不佳等。PLA是在所有材料中亲水性最好，PLA的代谢产物能被完全吸收。PLA和PLGA的降解性能和机械性能更佳且无毒性，同时PLGA的降解性能和机械性能还能够通过调控二者比例进行调整。因此PLGA在软骨组织工程学中的一种前瞻性材料。PLGA的缺点为亲水性较差，吸收不佳。研究人员通过使用静电纺织对PLGA支架进行改良发现，改良后的PLGA支架可以成功用于软骨组织工程修复〔30〕。

多孔海绵支架的性质与纤维支架相类似。多孔海绵的孔隙大小和孔隙分布等会影响细胞黏附、相互作用及细胞形态学和结构力学性能。高孔隙度使多孔海绵能够为软骨细胞表型提供更好的三维结构支持。研究人员发现，软骨细胞在一种Ⅰ型胶原蛋白/多孔海绵支架中能够最好地维持球状表型〔31〕。但是多孔海绵的多空隙也导致了其机械性能不佳，如何研发出性能更佳的多孔海绵支架是今后研究的重要方向。

2.3生物学要素 种子细胞诱导分化为软骨细胞需要多种生长因子和形态发生决定子参与完成。这些因子主要包括转化生长因子(TGF)-β、成纤维细胞生长因子(FGFs)、表皮生长因子(EGF) 、胰岛素样生长因子(IGF)和骨形态发生蛋白(BMP)、结缔组织生长因子(CTGF)等。研究人员发现，自体软骨细胞功能障碍时表型会发生改变易分化为成纤维细胞，但是通过使用三维细胞培养和对FGF-2、EGF、 TGF-β及血小板衍生因子(PDGF)-BB等进行调控可以使障碍的软骨细胞进行反分化。

TGF-β家族成员TGF-β1和β3生长因子对MSCs分化起到重要作用。因此使用TGF-β1和TGF-β3是诱导MSCs分化最常用的方法〔32〕，其中TGF-β3的诱导能力更是居于TGF-β家族前列。BMP能够调控软骨形成同时还会影响成骨，其中BMP-2能够促进Ⅰ型胶原蛋白基因表达，Ⅱ型胶原和糖胺聚糖的沉积。CTGF在刺激MSCs向软骨细胞分化过程中能够对软骨细胞的增殖和分化促进起促进作用，从而增加软骨细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖的表达。缺乏CTGF会使MSCs在分化过程中增加腱调蛋白(TNMD)表达使软骨细胞韧带化〔33〕。

综上，膝骨关节炎软骨损伤一直是临床诊治的难点。软骨组织工程在过去的几年里有了很大的发展，软骨修复的方法越来越多，成功率也越来越高。然而，膝骨关节炎是一种多因素作用导致的软骨内环境稳态和关节炎症交错作用的复杂疾病。因此，治疗膝骨关节炎软骨损伤需要从多种角度选择不同的组织工程策略进行治疗。

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