miRNA-31靶向基质金属蛋白酶-3基因对宫颈鳞癌侵袭力的影响

肖 黎 张水蓉 胡 萍 陈 燕 张思思

(荆州市中心医院妇产科，湖北 荆州 434020)

全球每年新增宫颈癌病例约47万，每年近23万患者死于宫颈癌〔1〕，严重威胁女性健康。微小RNA(miR)是一类长度在20～23个核苷酸编码的内源性小RNA，广泛存在于各种生命体。miR参与人类全部细胞周期过程，并调控人类约60%蛋白编码基因〔2〕，而miR异常表达会导致各种疾病的发生，在肿瘤中miR通过对下游靶基因的调控，发挥癌基因或抑癌基因的功能〔3〕，已在肺癌〔4〕，胃癌〔5〕，乳腺癌〔6〕等多种肿瘤中得到证实。 miR-31被认为是一种抑癌基因，参与多种肿瘤的发生发展，本文观察上调miR-31后检测基质金属蛋白酶(MMP)-3相关指标及侵袭的变化，进一步了解miR-31在宫颈鳞癌细胞系中的生物学功能。

1 材料与方法

1.1材料 组织标本来自于荆州市中心医院2014年5月至2015年7月，收集新鲜宫颈鳞癌16例，正常宫颈组织16例，均为病理确诊，所有标本来源患者无其他肿瘤疾病，未进行过放射或化学治疗。siHa细胞系(上海通派生物公司)。

1.2细胞培养及转染 将解冻复苏的siHa细胞放置于5%CO2，37℃恒温箱中培养，并进行传代，转染前将细胞接种于6孔板中，设置实验组、阴性对照组、空白对照组，消化后当细胞密度达60%左右时，取2 μl/孔lipo2000，稀释于200 μl无血清含各种氨基酸和葡萄糖的培养基(DMEM)，轻混摇匀室温孵育5 min，与含有4 μl miR-31 mimic的无血清DMEM稀释液200 μl混合摇匀，室温静置15 min；取该混合物加入siHa细胞孔板中，温箱培养4 h后更换为含血清DMEM，继续培养48 h后提取总RNA或蛋白。

1.3逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测 收集组织或细胞，匀浆后，Trizol提取液按(1 ml/100 mg组织；1 ml/107个细胞)进行总RNA的提取，并对总RNA进行质量控制。以提取的总RNA，室温溶解，于冰上配置RT体系25 μl：5×RT缓冲液1 μl，总RNA 2 μl，Poly A聚合酶1 μl，RTase 1 μl，ddH2O 20 μl，摇匀后，37℃孵育45 min，85℃灭活反应酶5 min。PCR体系20 μl：2×成熟体(All-in-oneTM) q-PCR混合物10 μl，All-in-oneTMmiRNA qPCR引物2 μl，50×凹槽氧化参比染料0.4 μl，cDNA (稀释1∶5～1∶10)2 μl，ddH2O 7.6 μl。95℃ 10 min，预变性；95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 10 s，40个循环。以U6RNA作为内参照，按2-△△Ct法计算miR相对表达量。引物序列：miR-31 mimic正向链5′-UGCCAAGATGCTGGCATACAU-3′。同法以提取的总RNA逆转录，以GAPDH作为内参照，计算MMP-3 mRNA的表达量(引物序列MMP-3：5′-CCTGCTTTGTCCTTTGATGC-3′)。

1.4采用Transwell小室实验检测宫颈癌siHa细胞株侵袭性 常规制备Transwell小室，收集消化后的各组细胞，悬浮后，按2.5×104个细胞/孔加入上室，下室加入含血清培养基，放于温箱培养48 h后，去除上室Matrigel胶和细胞，下室甲醇固定，结晶紫染色，高倍光镜下进行计数。

1.5Western印迹检测MMP-3的蛋白表达 收集转染后48 h，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2遍，加蛋白提取液，冰上裂解10 min，匀浆后，取上清超声2次，再10 000 r/min 10 min，再取上清，进行蛋白定量。取等量蛋白(40 μg)于12%的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，把蛋白转到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，封闭1 h，分别用GAPDH和MMP-3一抗4℃孵育过夜,二抗孵育1 h后Tween-20 Tris盐酸缓冲液(TBST)漂洗3次。然后用电化学发光(ECL)试剂暗室显影。

1.6统计方法 采用SPSS18.0统计软件进行t检验、方差分析。

2 结 果

2.1两种组织标本中miRNA-31的表达 与正常宫颈组织(0.659±0.03)对比，宫颈鳞癌组织miR-31(0.045±0.01)明显下调(P<0.01)。

2.2miR-31在各组宫颈siHa细胞的表达情况 检测转染后24 h，实验组miR-31(0.751±0.04)明显高于阴性对照组(0.032±0.03)及空白对照组(0.041±0.08)(P<0.01)，表明实验成功上调miRNA-31表达。

2.3转染48 h后siHa细胞MMP-3 mRNA的表达情况 实验组MMP-3 mRNA(0.473±0.188)、阴性对照组(0.492±0.288)及空白对照组(0.388±0.150)差异无统计学意义(F=0.514，P>0.05)。

2.4转染后48 h MMP-3蛋白表达量 MMP-3蛋白的表达量分别为实验组(24 837.7±2 930.8)、阴性对照组(18 144.0±3 265.9)、空白对照组(16 111.2±2 416.7)，实验组MMP-3蛋白的表达量显著高于阴性对照组及空白对照组(P<0.01)；而阴性对照组与空白对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。

2.5上调miR-31对宫颈siHa细胞侵袭性的影响 在转染后48 h，实验组平均侵袭数(36.6±3.21)，空白对照组(49.4±3.05)，阴性对照组(46.0±3.65)，实验组较空白对照组和阴性对照组侵袭数明显减少(P<0.01)，上调siHa细胞中miR-31的表达，可显著抑制细胞的侵袭能力。

3 讨 论

研究显示miR可以通过调解下游靶基因表达的方式参与细胞增殖、分化、转移等生理病理过程〔7〕。Guo等〔8〕通过生物预测发现miR-15b及miR-16同时靶向bcl-2，并通过实验方法上调肝细胞中miR-15b及miR-16的表达降低bcl-2基因表达，增加含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspases)3、8、9表达，证实了miR-15b/bcl-2/caspases3、8、9及miR-16/bcl-2/caspases3、8、9凋亡调节通路的存在。本研究结果与黄晨等〔9〕研究相符，上调miR-31的相对表达可诱导宫颈癌细胞的凋亡，并抑制癌细胞的淋巴转移。通过对miR-31进行靶基因预测，MMP-3为其3′-非翻译区(UTR)潜在靶基因。MMP家族参与组织重塑、血管形成，并是参与细胞外基质(ECM)降解的内肽酶〔10，11〕，最近研究还显示MMPs在调控肿瘤细胞生长、细胞凋亡、侵袭及免疫监视中发挥重要作用〔11〕。MMP-3能激活其他几种MMPs，包括MMP-1、MMP-9〔10〕，而研究显示MMP-1、MMP-7，MMP-9，MMP-13在原发实体肿瘤及转移瘤中高表达。

研究证实MMP-3在肺癌中的表达与癌细胞转移情况呈正相关，而且在转移病灶中MMP-3的表达量显著升高〔12〕。本实验提示miR-31与MMP-3基因3′-UTR结合后，导致MMP-3 mRNA翻译受阻；miR-31可靶向调控MMP-3基因。Zheng等〔13〕证实miR-31作为原癌基因参与宫颈癌的发生及进展，与本文一致。

一种miR可靶向调节多个基因的表达，而同一个靶基因又可接受多个miR的调控，所以有关miR与其靶基因的复杂网络关系还有待明确，但miR-31有可能成为宫颈癌治疗或预后评价的关键基因。

4 参考文献

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8Guo CJ，Pan Q，Li DG，etal.miR-15b and miR-16 are implicated in activation ofthe rat hepatic stellate cell：an essential role for apoptosis〔J〕.J Hepatol,2009；50：766-78.

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12Brzóska K，Bartomiejczyk T，Sochanowicz B，etal.Matrix metalloproteinase 3 polymorphisms as a potential marker of enhanced susceptibility to lung cancer in chronic obstructive pulmonary disease subjects〔J〕.Ann Agric Environ Med,2014；21：546-51.

13Zheng W，Liu Z，Zhang W，etal.miR-31 functions as an oncogene in cervical cancer〔J〕.Arch Gynecol Obstet,2015；292：1083-9.