自噬与姜黄素抗肿瘤作用的关系

徐继明，丁浩然，李质馨，王弘珺

吉林医药学院组织学与胚胎学教研室，吉林 132013

姜黄素是从姜黄根茎中提取到的酸性多酚类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗凝、降血脂、清除自由基、抗动脉粥样硬化等作用[1]。尤为重要的是，美国国立卫生研究院已经批准在腺瘤、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌等多种癌症的临床试验中应用姜黄素。其抑制肿瘤机制包括，调控癌基因、抑癌基因表达，导致细胞周期阻滞或细胞凋亡；抑制血管内皮生长因子减少肿瘤新生营养血管生成[2]。近年研究显示，姜黄素可以诱导肝癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌、胶质瘤、白血病等多种肿瘤细胞自噬[3]。鉴于细胞自噬在肿瘤细胞生存与凋亡中起双向作用，本文主要综述细胞自噬的研究进展，姜黄素诱导肿瘤细胞自噬的途径及其与肿瘤细胞凋亡的关系，为姜黄素调控细胞自噬及治疗肿瘤提供理论基础。

细胞自噬的分类、过程与机制

细胞自噬是细胞为了应对缺氧、代谢应激和ATP消耗，将细胞质基质、大分子物质和过量或损伤的细胞器靶向运输到溶酶体降解的过程[4- 5]。细胞自噬受自噬相关基因调控，这些基因高度保守，在哺乳动物间有同源体。在一定程度上细胞自噬维持了蛋白质和细胞器的更新及清除平衡，避免细胞凋亡发生，但是过度自噬可能导致细胞死亡。细胞发生自噬性死亡时，细胞内可见大量自噬体和自噬性溶酶体，这是自噬性死亡区别于细胞凋亡以及细胞坏死的主要特征。

细胞自噬分类根据底物进入溶酶体的途径，将细胞自噬分为3种类型：微自噬、分子伴侣介导的自噬和巨自噬[6]。微自噬是溶酶体膜内陷，直接将细胞内物质吞入并降解的过程。分子伴侣介导的自噬是可溶性蛋白质被分子伴侣识别，与溶酶体膜蛋白结合，穿过溶酶体膜，进入溶酶体后再被降解的过程[7]。通常所指的细胞自噬为巨自噬，细胞质中的物质被双层膜包裹形成自噬体，再转运到溶酶体降解的过程。

细胞自噬过程细胞自噬过程主要分为以下阶段，首先，细胞启动自噬反应，胞浆中出现大量的游离膜性结构，称为前自噬泡，这些双层膜来源于内质网、高尔基体或者线粒体[8- 10]。随着膜的逐渐延伸，需要降解的物质被膜结构完全包绕形成自噬体，然后自噬体与溶酶体靶向融合形成自噬性溶酶体。自噬体外膜与溶酶体膜融合，自噬体内膜及其包裹的物质进入溶酶体，被溶酶体酶降解，降解产物返回胞浆循环使用。

细胞自噬机制细胞自噬受多种信号途径调控，磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidyl inositol 3-kinase，PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)(Akt)-雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号是调控自噬的主要信号[11- 13]。mTORC1通过直接磷酸化自噬相关基因13(autophagy-related gene 13，ATG13)和Unc- 51样自噬激活激酶1(Unc- 51-like autophagy activating kinase 1，ULK1)，抑制细胞自噬。细胞内ATP减少或AMP/ATP增加时，腺苷酸激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)通过磷酸化mTOR调控相关蛋白Raptor 抑制mTORC1活性、解除mTORC1对细胞自噬的抑制作用。尤为重要的是AMPK激活ULK1，ULK1激活并磷酸化ATG13，形成ULK1-ATG13-黏着斑激酶家族相互作用2蛋白(FIP200)-ATG101复合体，活化的ULK1复合体从细胞质转移到内质网或其他位置，开始形成自噬膜。然后ULK1激活PI3K Ⅲ复合体(由Vps34、Beclin- 1、Vps15、ATG14等组成)活化细胞自噬反应。PI3K Ⅲ复合体通过结合紫外线抵抗相关基因和自噬/苄氯素1调节因子1催化Vps34活性。活化的Vps34促进磷脂酰肌醇3磷酸[PtdIns(3)P]形成，PI3P招募 WD重复结构域磷酸肌醇交互蛋白2[14]促进早期自噬体形成，并与囊泡形态有关。在启动细胞自噬时，ULK1至关重要。

自噬泡的延伸和成熟依赖泛素样自噬体蛋白系统、ATG12系统和ATG8系统(与哺乳动物LC3同源)。由WD重复结构域磷酸肌醇交互蛋白2招募ATG16L1与ATG5和ATG12形成ATG12-ATG5-ATG16L1超分子蛋白复合体(即ATG12系统)，决定自噬泡的形成位置[15]。然后，ATG12系统充当E3泛素酶将磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine，PE)连接到ATG8系统。先由蛋白水解酶ATG4切割LC3为LC3-I，在ATG7和ATG3作用下LC3-I和PE连接成LC3-Ⅱ(ATG8/PE复合体)[16]。LC3-Ⅱ促进自噬体的扩展以及成熟，它是自噬体的标志蛋白，吸附于自噬体膜[17]。自噬体的最终形成受ATG2A和ATG2B调节，具体过程并不清楚。

姜黄素诱导肿瘤细胞自噬的机制

借助荧光显微镜和电子显微镜，有研究显示姜黄素处理的肺腺癌A549细胞出现自噬体与自噬性溶酶体，3-MA抑制自噬作用后A549细胞存活率增加[18]，表明姜黄素调控自噬反应与肿瘤生存相关。现有研究表明，姜黄素能诱导口腔癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、肺腺癌、子宫平滑肌肉瘤等多种肿瘤发生自噬，受姜黄素调控的自噬信号如下。

姜黄素通过AMPK-mTOR信号调控细胞自噬姜黄素诱导人黑色素瘤A375和C8161细胞以及胃癌SGC- 7901和BGC- 823细胞发生自噬时，降低了磷酸化AKT、mTOR及S6K1表达，表明姜黄素抑制PI3K-AKT-mTORC1信号途径，促进细胞自噬[19- 20]。另有研究显示,在乳腺癌MDA-MB- 231细胞中使用姜黄素后，增加AKT泛素化并促进AKT聚集，结果AKT表达降低；应用自噬抑制剂CQ、shRNA敲除ATG5或ATG7阻断自噬后，AKT表达增加[21]。表明姜黄素促进AKT聚集并通过自噬途径降解AKT，因此激活了mTORC1信号，从而促进细胞自噬。进一步研究显示姜黄素增加结肠癌SW480和SW620细胞的磷酸化AMPKα表达，导致mTORC1下游信号S6K1及其底物S6的磷酸化降低，表明姜黄素具有调控AMPK-mTORC1信号通路的作用[22]。在应用AMPK特异性抑制剂阻断AMPK信号或者小干扰RNA敲除AMPKα1后，由姜黄素诱导的A549细胞自噬受到抑制[23]。综上，姜黄素通过激活AMPK活化TSC1/2，进而抑制mTORC1信号，促进肿瘤细胞自噬发挥其抗肿瘤作用。目前尚不清楚，姜黄素调控AMPK激活肿瘤细胞自噬的机制，以及姜黄素对线粒体AMP、ATP代谢的影响等，相关研究仍需深入。

姜黄素调控转录因子EB激活细胞自噬转录因子EB(transcriptional factor EB，TFEB)是mTOR下游的直接作用靶点，是调控细胞自噬和溶酶体发生的主要分子。通常mTORC1磷酸化TFEB，使其定位于胞浆,其活性受到抑制[24]。当细胞饥饿或药物抑制mTORC1时，TFEB转位至细胞核调控基因转录，激活溶酶体功能，诱导细胞自噬[25]。在结肠癌HCT116细胞中，姜黄素抑制AKT-mTORC1通路，降低了磷酸化AKT和S6K1，促进细胞自噬[26]。原因是姜黄素增加TFEB表达并且结合于TFEB，促进其核转位，增加了下游靶分子溶酶体膜蛋白1、紫外线抵抗相关基因和ATG9B的表达，进而激活自噬和增加溶酶体功能。另有研究显示姜黄素类似物C1也具有结合TFEB促进其核转位、激活TFEB的作用[27]。总之，姜黄素一方面调控AMPK-mTORC1信号激活细胞自噬，另一方面激活TFEB，增加溶酶体功能促进细胞自噬。

姜黄素通过Beclin-1/Bcl-2调控细胞自噬Beclin- 1/Bcl- 2是调控细胞自噬与凋亡的重要分子，Beclin- 1参与PI3K Ⅲ复合物，对自噬泡的形成至关重要；Bcl- 2具有抑制细胞凋亡的作用，并且Bcl- 2结合Beclin- 1阻止PI3K Ⅲ复合物形成、抑制细胞自噬反应[28]。当细胞营养充足时，Bcl- 2结合Beclin- 1和Bax/Bak，细胞自噬与凋亡均被抑制。当细胞饥饿时，c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK1)活化并磷酸化Bcl- 2，Beclin- 1/Bcl- 2复合物解体，Beclin- 1促进细胞自噬；而磷酸化Bcl- 2结合Bax，保证线粒体膜完整，避免细胞色素C释放，细胞凋亡被抑制。当细胞极度饥饿时，JNK1使Bcl- 2高度磷酸化，Bcl- 2与Bax分离，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3被激活诱导细胞凋亡[29]。研究显示姜黄素能降低Bcl- 2表达、增加Beclin- 1和LC3-Ⅱ表达，同时激活细胞凋亡与细胞自噬[20]。应用苄氧羰基缬氨酸-丙氨酸-天冬氨酸氟甲基酮抑制细胞凋亡、Baf-A1抑制自噬后，白血病K562细胞死亡降低，表明自噬与凋亡是姜黄素诱导K562细胞死亡的机制[30]，表明调控自噬反应是姜黄素的抗肿瘤机制。

姜黄素通过内质网应激途径调控细胞自噬肿瘤细胞经常面临缺氧、营养缺乏、氧化应激以及高代谢等情况，由此引起的蛋白合成和折叠紊乱激活了内质网应激。细胞通过调控内质网核信号1、蛋白激酶R样内质网激酶及活化转录因子6增加蛋白质折叠、抑制蛋白质合成或者加速蛋白质降解，重建内质网稳态，维持其功能。如果不能维持内质网稳态，肿瘤细胞将发生凋亡。姜黄素作用于肝细胞癌Huh- 7细胞时，激活内质网应激信号，葡萄糖调节蛋白78、C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白升高，内质网释放Ca2+，线粒体摄取Ca2+引起细胞色素c释放，启动细胞凋亡。但是低浓度姜黄素或者作用早期，姜黄素可以激活自噬反应清除损伤线粒体，避免细胞凋亡[31]。表明姜黄素通过激活内质网应激调控线粒体Ca2+信号，实现对细胞自噬与凋亡的调控。

总之，姜黄素通过调控AMPK-mTOR、Beclin- 1/Bcl- 2、TFEB、内质网应激、活性氧以及细胞外信号调节激酶1/2等信号[2，32- 34]调控自噬反应，在不同肿瘤细胞中，其调控细胞自噬机制不完全相同。

姜黄素诱导自噬对细胞凋亡的影响

不同肿瘤细胞对姜黄素的反应性不尽相同，既存在姜黄素活化自噬增加细胞凋亡的证据，也存在姜黄素活化自噬促进细胞生存的证据。例如，单独使用自噬阻断剂，并未明显抑制胃癌细胞生存，但是联合使用自噬阻断剂与姜黄素时，细胞凋亡率显著增加[20，35]。另外，JNK途径是调控细胞自噬与凋亡的重要信号，在骨肉瘤MG63细胞中，姜黄素诱导细胞凋亡，并且上调p-JNK和ATG5促进细胞自噬。联合使用姜黄素和自噬抑制剂3-MA后，3-MA阻止磷酸化JNK和ATG5的上调、抑制细胞自噬，促进了MG63细胞凋亡[36]。上述研究表明，活化自噬反应是一种细胞保护性机制，阻断自噬增加了姜黄素的促凋亡作用。由于细胞自噬与凋亡受多种相同信号途径调控，因此二者之间存在交互作用。例如，Bcl- 2是调控细胞凋亡的关键分子，Beclin- 1对于激活细胞自噬至关重要，一方面姜黄素降低Bcl- 2表达、解除了Bcl- 2对Beclin- 1的抑制，另一方面姜黄素增加Beclin- 1表达，因此姜黄素诱导细胞凋亡的同时激活了细胞自噬。然而转移性乳腺癌MCF- 7细胞过表达Bcl- 2，则Bcl- 2结合Beclin- 1抑制自噬反应，因此肿瘤细胞出现姜黄素抵抗[37]。如果应用抑制剂阻断PI3K-AKT信号通路，就能增加姜黄素的促凋亡作用，克服Bcl- 2过表达对细胞自噬的抑制作用，促进MCF- 7细胞凋亡。综上，作为多靶点抗肿瘤药物，姜黄素具有调控细胞自噬和促进细胞凋亡的作用。对于多数肿瘤细胞，低浓度姜黄素激活细胞自噬促进肿瘤生存；持续作用后，姜黄素诱导的自噬反应或者转变为自噬性死亡或者促进细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤作用。

小结与展望

细胞自噬在多种疾病发生、发展中发挥重要作用，姜黄素的抗肿瘤机制及其临床应用是中药抗肿瘤研究的热点之一。大量研究表明，在肿瘤形成前细胞自噬减少毒性物质蓄积、稳定基因组，从而抑制癌变，一旦肿瘤形成，细胞自噬将为肿瘤细胞提供营养。鉴于细胞自噬在肿瘤发生中的双重作用以及细胞自噬与细胞凋亡的交互作用，因此深入探究姜黄素调控细胞自噬对肿瘤的影响非常必要，相关研究将为肿瘤治疗提供新思路。此外，姜黄素也被用于治疗心肌缺血、阿尔茨海默病以及衰老等，在这些研究中，姜黄素诱导细胞自噬减轻了心肌细胞、神经细胞的病理损伤。总之，姜黄素具有广泛的临床应用前景，其作用机制尚需深入研究。