国槐人工杂交技术研究

庞彩红 ，亓文英 ，李双云 ，夏 阳 ，杨 勇 ，乔玉玲 ，孙 超 ，毛秀红 ，臧真荣 ，刘盛芳

（1.山东省林业科学研究院，山东 济南 250014；2.山东省林木遗传改良重点实验室，山东 济南 250014；3.安丘市林业局，山东 潍坊 262100；4. 平凉职业技术学院，甘肃 平凉 744000）

随着现代遗传学理论的不断发展，人工创造变异的方法和新的林木育种手段不断出现，但到目前为止，最基本的林木育种方法仍然是林木杂交育种[1-2]，杂交能创造出适合生产上需要的新基因型，其生长发育或抵抗性往往比两个亲本原种更为优越；还可以利用杂交手段组配特殊的性状，以解决生产上的特殊需求，而人工杂交育种是林木杂交育种的一个重要方法。刘孟军等[3]从枣树的亲本选择、免去雄控制杂交、授粉方法、胚培养等方面对枣树杂交育种进行了探讨与研究；王湘南等[4]对来自湖南、江西主产区不同种源油茶主栽品种在相同立地环境条件下开花授粉习性进行观测研究，发现开花授粉习性与品种花期早晚、花期长短以及可授性与可配性、坐果率等密切相关，人工杂交授粉坐果率可高达88.0%；此外在桉树、红花油茶、油桐以及果树上也取得一定进展[5-9]。国槐Sophora japonica在分类上属于蝶形花科Papilionaceae槐属Sophora，原产中国，现南北各省区广泛栽培，华北和黄土高原地区尤为多见[10]。国槐树冠优美，花芳香，是行道树和优良的蜜源植物；具复圆锥花序，顶生，同一花序上的小花发育程度不同，开放时间也不同；花期7—8月，从花序基部依次向末端开放，这使得国槐花期时间较长，在绿化和园林配置中有较好的观赏效果。国槐花量虽大，但自然落花情况严重，尤其是初花期和盛花期的前期，绝大部分花朵都败育脱落，这一自然现象的存在使人工授粉杂交育种难以实施。因此，如何建立适宜国槐授粉杂交方法、获得杂交种子成为国槐人工育种成败的关键。到目前为止尚未见到相关文献报道。本试验以聊红槐为父本，不同树龄生长良好的普通国槐为母本，探索建立国槐人工授粉杂交的适宜方法，以期为国槐杂交育种提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 研究材料

试验材料的母本为长势健壮、开花结果正常的普通国槐，种植于山东省林业科学研究院寿光盐碱地试验站种质圃，位于寿光市北部，全年平均气温13℃，年均降水量600 mm，年均蒸发量2 200 mm，地下水位2～3 m，全年无霜期195 d。父本为聊红槐Sophora japonica‘Liaohong’，种植于聊城大学国槐试验园（由品种选育者邱艳昌先生提供）。

1.2 脱落花朵的统计

从7月初国槐初花期开始，每天中午收集当天脱落的花朵50～100朵，统计长雌蕊和中短雌蕊的花朵数，连续观察1个月。

1.3 花粉萌发的观察

参考牛艳娥等[11]方法并加以改进，国槐花粉萌发固体培养基为琼脂20 g/L+蔗糖10 g/L+硼酸50 mg/L。25℃条件下培养4～5 h，显微镜下观察萌发情况。

1.4 雌蕊形态的观测

利用解剖镊子将花瓣轻轻去掉，露出雌蕊和雄蕊，放在解剖镜下观察，拍照。

1.5 雌蕊柱头可授性检测

参考叶要妹等[12]的方法。柱头呈现蓝色并伴有大量气泡出现，表明柱头进入最佳可授期；柱头外缘变蓝有少量气泡产生，为可授期；柱头不变蓝没有气泡，为不可授期。

1.6 人工授粉

在晴朗天气的早上，选择当天盛开的花朵，将花粉磕到硫酸纸上，包好，放在呈有干燥剂的干燥器中，带回实验室干燥12 h后，冷藏（4℃）5～7 d[11]。杂交前，挑选含苞待放的大花朵进行去雄，并摘除花序上所有花朵及小果荚。用小号毛笔蘸取收集好的花粉，轻轻涂抹在已去雄花朵的雌蕊柱头上，柱头显示为淡黄色，说明花粉已成功涂抹上，授粉结束。再将整个花序用授粉袋套起来，并套上注明父本和母本、授粉时间、授粉花朵个数的标签。授粉5～7 d后去袋，统计花朵授粉率；3个月后，统计坐果率。

式中：r为成功授粉花朵数；p为杂交成熟果实数；V为杂交授粉花朵数。

1.7 播 种

授粉3个月后采摘的绿色果荚，用75%酒精浸泡5 min后，无菌滤纸上吸干多余的酒精和水分，用镊子和剪刀将果皮和种皮去掉，接种到MS培养基上，每瓶接种3粒。16 h光照/8 h黑暗培养，温度为18～25 ℃。当幼苗长至2 片真叶时，统计种子萌发率。

授粉4个月后，种子完全成熟。用清水浸泡1 d后去除果皮，晾干，室温保存。翌年春天用80 ℃热水浸泡保存后的杂交种子，边倒水边搅拌。浸泡24 h后，捞出种子放入干净的塑料盆中，覆盖潮湿的纱布保湿。每天用清水冲洗种子2次，直至露白。露白种子播种在直径12 cm的无纺布营养钵中，每个营养钵种2粒种子。播后覆盖1 cm 营养土，浇透水。每周浇透水1次，当小苗长至2 片真叶时，统计出苗率。

2 结果与分析

2.1 授粉期对国槐授粉率和坐果率的影响

授粉时期的早晚直接决定授粉率的高低，选择合适的授粉时期对于人工杂交育种至关重要[13-14]。国槐初花期的花朵一般自然脱落，此时脱落花朵中短雌蕊花朵所占比例达80%以上，随后，长雌蕊花朵所占比例逐渐增大。当脱落花朵中长雌蕊花朵所占比例达到50%以上且花枝上出现已经自然授粉成功的小果荚时进行人工授粉，可使国槐的人工授粉率达80%以上，坐果率达30%以上。这些授粉成功的花朵一般都位于花枝中末端。授粉期间，晴朗天气上午人工授粉的授粉率和坐果率分别是90%和36.1%，下午的授粉率和坐果率分别是88.3%、34.9%（见表1），差异不明显。

表1 国槐授粉率和坐果率与脱落花朵中长雌蕊花朵比例及授粉时间的关系Table1 Ratio of long pistil flower, artificial pollination rate and seed setting rate

2.2 花朵发育状态及柱头可授性对授粉率的影响

解剖镜下观察国槐花朵的形态发现，开放花朵的花药已经完全裂开，释放出黄色花粉，雌蕊的柱头上也已密布成熟花粉（见图1C），因此开放花朵不能用来进行人工授粉；对于未开放的花朵来说，花药尚未裂开，花粉没有释放出来，柱头未被花粉污染（见图1G），这样的花朵符合授粉的要求。但并不是所有未开放的花朵都能用来进行人工授粉，通过联苯胺-过氧化氢染色柱头发现只有那些含苞待放的大花朵（长度大于14 mm）柱头外缘变蓝且有少量气泡产生，具有可授性，这样的花朵一般在第二天早上都会盛开，可用于人工授粉。

图1 花朵形态(上：开放花朵；下：含苞待放花朵)Fig.1 Shape of fl owers (Upper: blooming fl owers; Lower: fl owers in bud)

2.3 花朵雌蕊长度对授粉率的影响

如图2所示，解剖镜下观察发现，国槐花朵存在长、中、短3种类型的雌蕊，早期开放的花朵一般是短、中型雌蕊，都会自然脱落，人工授粉过程中也发现这两种类型的花朵不能完成授粉；后期开放的花朵一般具有长雌蕊，自然状态下能够授粉结出果荚，可选择此种类型的含苞待放的花朵进行人工授粉。

图2 长、中、短3种类型雌蕊形态Fig.2 Shape of long, middle and short pistil

2.4 授粉母树树龄对授粉率和坐果率的影响

园林树木生命周期长，从种子萌发到具有开花潜能的成熟期需要几年到几十年，母树树龄过幼或者过大对人工授粉的效果影响明显。如表3所示，国槐树龄超过30 a，其人工授粉的授粉率为8.6%，结实率为0，因此不能选择树龄超过30 a的树木作为母树；树龄在15～20 a的母树其人工授粉率接近90%，坐果率为37.4%；树龄在10 a左右的国槐坐果率不稳定，不适合用来进行人工授粉。

表2 不同树龄的国槐授粉率与坐果率Table 2 Artificial pollination rate and seed setting rate of different ages of mother tree

2.5 育 苗

杂交种子在MS培养基中播种80粒，出苗 80棵，出苗率为 100%；无纺布营养钵中播种80粒，出苗54棵，出苗率为67.5%，出苗率低于无菌育苗方法的出苗率，这可能是种子干燥过程中种皮变得致密坚硬，透气性、透水性变差，影响了种子的发芽率。由此可见，尽早收集种子，进行无菌育苗是提高国槐杂交种子出苗率的首选方法。

3 结论与讨论

为了提高人工授粉率及坐果率，需要找到适宜的授粉方法。不同植物的开花结实习性不同，人工授粉方法各异。大棚栽培条件下，翠冠梨Pyrus pyrifolia开花后3 d内为最佳授粉时间，在这期间授粉对大棚翠冠梨的坐果率、种子数、种子百粒重均无显著影响[13]；油茶Camelia oleifera最佳授粉时间在单花开放第1～5 天，单花寿命越长其可授期就越长久[4]；刺槐Black locust[15]开花前1～2 d去雄，此时花瓣闭合，花药未开裂，柱头表面干净无花粉，去雄后2 d 内授粉，否则柱头干燥，且可授性差，杂交结实率为3.56%。本研究表明，国槐开花前1 d去雄，此时花药未开裂，柱头表面干净，去雄后立即授粉杂交，坐果率可在30%以上，与刺槐的授粉特性相似。国槐初花期花朵一般自然脱落，脱落花朵中占比例达80%以上的是中、短型雌蕊花朵（柱头明显低于花丝），这也是造成初花期授粉率极低、坐果率为0的主要原因，这种现象在多种植物中存在，花生中短柱头花朵的授粉率明显低于正常花朵[16]，石榴花中雌蕊柱头显著低于雄蕊时，柱头表面分泌物少，花粉不能正常黏合，难以进入花柱萌发形成花粉管[17]，因此也不能正常授粉结果。当国槐长雌蕊花朵比例达到50%～60%时，进入盛花期，是人工授粉的适宜时期，此时授粉率在80%以上，坐果率达30%以上。国槐最佳授粉时间就整个母树花期而言，通过统计脱落花朵长雌蕊与中短雌蕊花朵比例来确定；就单个花朵而言，通过柱头可授性检测和雌蕊长度来确定；就整个花枝而言，授粉成功的花朵一般都位于花枝中末端。此外，天气和病虫害也会大大降低国槐人工授粉率和坐果率，2015年国槐人工杂交授粉率和坐果率分别为85.5%和16.8%（实验室已有结果），因当年7月份雨天较多且有蚜虫危害，授粉去袋后发现子房虽授粉膨大但布满蚜虫，甚至有些已萎蔫，导致后期的坐果率过低，因此国槐人工授粉要选择晴朗天气进行，授粉之前要提前防治蚜虫。

因树木种类的不同，到达成年期所需的时间也各不相同，刺槐需要4～5 a、侧柏6～10 a、油松7～10 a、国槐10 a左右，刚进入成年期的国槐花量不大，结实率很低，此时进行人工授粉效果差，15～20 a的国槐进入开花结果的高峰期，且生长旺盛，营养充足，此时进行人工授粉效果最好。超过30 a树龄的国槐人工授粉效果差，可能是随树龄的增长，生长势变弱，病虫害增加所致；随着树龄的增长，花朵对外界的刺激变得更加敏感，去雄及套袋对花发育的不利影响变大，导致授粉率及坐果率降低。对于园林绿化树种及用材树种进行人工杂交育种时，应选择开花结实量大、花芽发育完全、生长旺盛、处于壮年期的母株。

结论：当脱落花朵中长雌蕊花朵所占比例达到50%以上时，选择树龄15～20 a、长势健壮的母株且具有长雌蕊的含苞待放的大花朵，于晴朗天气进行人工授粉，其授粉率在80%以上，坐果率在35%以上，这样的花朵一般位于花枝的中末端，此方法简单，便于大田操作，为国槐人工授粉提供了技术支持。

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