苯酚—硫酸比色法测定瑞丽白芨多糖含量

李国明 张丽萍 戴余波 张玉龙 李守岭 刘小琼

摘 要 采用水提醇沉法提取瑞丽白芨粗多糖，以苯酚-硫酸比色法测定白芨多糖含量。结果显示，最大检测波长490 nm，6%苯酚溶液用量1.2 mL，浓硫酸用量6.5 mL，反应时间60 min，测定结果较好，吸光度与葡萄糖浓度具有良好的线性关系，线性方程为y=0.009x+0.002 3，相关性系数R2=0.999 5。对白芨多糖样品进行加标回收率实验，加标回收率为99.11 % ，相对标准偏差RSD为0.763 3 %，实验准确度和精密度均较好。

关键词 苯酚-硫酸比色法 ；白芨多糖 ；含量测定

中图分类号 R284 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.10.014

Abstract The polysaccharide of Bletilla striata grown in Ruili was extracted by water extraction and alcohol precipitation， and determined by the phenol sulfuric acid colorimetry. The results showed that the polysaccharide was better determined when the maximum wave length was 490 nm， the volume of 6% phenol solution 1.2 mL， the volume of concentrated sulfuric acid 6.5 mL， the reaction time 60 mins. There was a good linear relationship between absorbance and glucose content， the linear equation was y=0.009x+0.002 3， and the relative standard deviation （RSD） was 0.763 3%. The determination of polysaccharide with this method was better in accurateness and preciseness.

Keywords phenol sulfuric acid colorimetry； polysaccharide of Bletilla striata ； content determination

白芨，系兰科植物白芨（Bletilla striata）的干燥块茎，又称小白芨、莲芨草、雪如末等[1]。白芨块茎主要成分为中性白芨杂多糖，属吡喃型葡甘聚糖[2]，为多个单糖（α-甘露糖、β-甘露糖和β-葡萄糖等）以糖苷键连接而成的聚合物[3]。

白芨多糖具有收敛止血、消肿生肌等功能[4]，对结核杆菌，肿瘤细胞等有明显的抑制作用[5]，常用于内外出血及痈肿、烫伤、手足皲裂、肛裂等病症[6]，对抗杆菌，抗真菌，阴虚咳嗽、肺热咳嗽、百日咳、肺结核咳嗽以及其它难治性咳嗽均有良好止咳作用[7]。同时还可以治疗鼻窦炎[8]，外用涂擦，可消除脸上痤疮痕迹[9]，使肌肤光滑无痕[10]。白芨多糖不仅参与了细胞生命的代谢和调节[11]，而且能增强机体免疫功能[12]，抗肿瘤[13]、抗肝炎[14]、抗溃疡、调血脂[15]、降血糖、抗衰老[16]等，具有良好的生物可降解性、相容性以及结构可修饰性，在药物递送系统、伤口敷料[17]及其他生物材料方面表现出巨大潜力和应用前景。

实验以葡萄糖为标准品，采用苯酚-硫酸比色法（硫酸将白芨多糖催化水解成单糖，单糖迅速脱水生成糠醛及其衍生物再与苯酚或蒽酮作用生成有色物质[18]，在适当波长和一定浓度范围内，吸光度值与多糖浓度呈线性关系，从而实现含量测定），对瑞丽市种植的白芨进行多糖提取及含量测定，确定白芨多糖含量的最佳分析测定条件，为进一步开发利用瑞丽市白芨资源提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

白芨：购买于瑞丽市台丽街综合批发市场（经鉴定为兰科白芨属白芨）。将白芨块茎洗净，沥干，切片，放入烘箱60℃烘干、粉碎后，过40目筛，收集，放入干燥器中密封保存，备用。

1.1.2 试剂

葡萄糖标准品，优级纯，国药集团化学试剂有限公司；苯酚，分析纯，天津市化学试剂三厂；浓硫酸，分析纯，重庆东川化工。

1.1.3 仪器

T6型紫外-可见分光光度仪（北京普析通用仪器有限公司）；UV-8000ST紫外-可见分光光度仪（上海元析仪器有限公司）；電子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；中药材粉碎机（台湾弘荃机械企业有限公司）；电热鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）。

1.2 方法

1.2.1 白芨粗多糖提取

称取白芨粗粉2.0 kg，用75 %乙醇提取2次，每次2 h，过滤，滤渣干燥。称取干燥后的滤渣1.0 kg，加入15倍量的水提取2 h，离心过滤后，滤渣再用10倍量的水提取2 h，合并滤液。将滤液浓缩至相对密度为1.15，加入95%乙醇，边加边搅拌，直至大量沉淀产生，静置过夜，滤出沉淀，干燥、粉碎即得白芨粗多糖。

1.2.2 溶液配制

葡萄糖标准溶液配制 精密称取已恒重的葡萄糖标准品0.100 1 g，溶解后，转移至100 mL容量瓶中，定容至刻度，充分摇匀，静置30 min。吸取2.0 mL于50 mL容量瓶中，定容，摇匀后，即得40.04 ug/mL的葡萄糖标准溶液。

待测样品溶液配制 精密称取已恒重的白芨粗多糖0.100 0 g，溶解后，转移至100 mL容量瓶中，定容至刻度，充分摇匀静置30 min。吸取2.0 mL于50 mL容量瓶中，定容，摇匀后，即得白芨粗多糖待测样品溶液。

6%苯酚溶液的配制 精密称取苯酚6.00 g，溶解后，转移至100 mL棕色容量瓶中，定容，充分摇匀，静置，避光保存。

1.2.3 最大吸收波长选择

分别吸取葡萄糖标准溶液0.0、1.0 mL于2支具塞比色管中，使总体积均为1.0 mL，加入6%苯酚溶液 1.2 mL，摇匀后，沿管壁缓慢加入浓硫酸6.5 mL，摇匀，静置，冷却。以葡萄糖标准溶液0.0 mL为空白对照，选择400～600 nm波长范围，按10.0 nm的精度进行多波长扫描，以吸收波长λ为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制吸光度-吸收波长关系曲线，确定最大吸收波长。

1.2.4 苯酚溶液用量的确定

分别吸取葡萄糖标准溶液各1.0 mL，置于9支具塞比色管中，依次加入6%苯酚溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，加水使各管体积均为3.2 mL，摇匀，各管分别沿管壁缓慢加入浓硫酸6.5 mL，摇匀，静置30 min。冷水冷却，于490 nm处测定吸光度。以苯酚用量为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制吸光度-苯酚用量关系曲线，确定苯酚溶液用量。

1.2.5 浓硫酸用量的确定

分别吸取葡萄糖标准溶液各1.0 mL，置于9支具塞比色管中，依次加入6%苯酚溶液1.2 mL，摇匀后沿管壁缓慢加入浓硫酸3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0 mL，加水使各管体积均为9.2 mL，摇匀静置60 min。冷水冷却后，于490 nm处测定吸光度。以浓硫酸用量为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制吸光度-浓硫酸用量曲线，确定浓硫酸用量。

1.2.6 稳定性实验

分别吸取葡萄糖标准溶液1.00 mL，置于9支具塞比色管中，加入6%苯酚溶液1.2 mL，摇匀后沿管壁缓慢加入浓硫酸6.5 mL，摇匀，分别静置10、20、30、40、50、60、70、80、90 min。冷水冷却后，于490 nm处测定吸光度。以反应时间t为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制吸光度-反应时间曲线，确定反应的适宜时间及稳定性。

1.2.7 标准曲线的制作

分别吸取葡萄糖标准溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于具塞比色管中，加水使体积均为1.0 mL，加入6%苯酚溶液 1.2 mL，摇匀后沿管壁缓慢加入浓硫酸6.5 mL，摇匀静置60 min。冷水冷却后，以葡萄糖标准溶液0.0 mL为空白對照，于490 nm处测定吸光度。以葡萄糖标准溶液浓度为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.8 精密度试验

分别精确吸取1.0 mL葡萄糖标准溶液于5支具塞比色管中，加入6%苯酚溶液1.2 mL，摇匀后沿管壁缓慢加入浓硫酸6.5 mL，摇匀静置60 min。冷水冷却后，以葡萄糖标准溶液0.0 mL份为空白对照，于490 nm处测定吸光度，计算相对标准偏差（RSD%）。

1.2.9 加标回收率试验

精密称取白芨样品5份，每份质量0.100 0 g，依次向白芨样品中加入0.070 0 g葡萄糖标准品，溶解定容至100 mL容量瓶中，摇匀，静置。吸取2.0 mL白芨样品溶液，定容于50 mL容量瓶，摇匀，静置。吸取0.4 mL于具塞比色管中，加水使体积均为1.0 mL，分别加入6%苯酚溶液 1.2 mL，摇匀后沿管壁缓慢加入浓硫酸6.5 mL，摇匀，静置60 min，冷水冷却后，以葡萄糖标准溶液0.0 mL为空白对照，于490 nm处测定吸光度。计算多糖含量及加标回收率。

加标回收率=（加标后多糖测定量-样品中多糖量）/葡萄糖标准品加入量×100%

1.2.10 白芨粗多糖中多糖含量的测定

精密称取已恒重的白芨粗多糖6份，每份质量0.100 0 g，配制成白芨粗多糖待测样品溶液，吸取6份待测样品溶液各1.0 mL于具塞比色管中，加入6 %苯酚溶液1.2 mL，摇匀后沿管壁缓慢加入浓硫酸6.5 mL，摇匀，静置60 min。冷水冷却后，于490 nm处测定吸光度，依据标准曲线计算白芨粗多糖样品中多糖含量。

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长的选择

由表1、图 1可知，最大吸收波长为490 nm。

2.2 苯酚溶液用量的确定

由表2、图 2可知。苯酚用量在0.2～1.2 mL，吸光度与苯酚用量呈正相关，且具有一定线性关系；当苯酚用量达到1.2 mL时，吸光度出现最大值；之后，随着苯酚用量的增加，吸光度反而逐渐下降。因此，最佳苯酚用量为1.2 mL。

2.3 浓硫酸用量的确定

由表3、图 3可知，使用1.2 mL 6%的苯酚溶液，浓硫酸用量在3.0～6.5 mL时，吸光度与浓硫酸用量呈正相关；当浓硫酸用量达到6.5 mL时，吸光度出现最大值；之后，随着浓硫酸用量的增加，吸光度呈现逐渐下降趋势。因此，最佳硫酸用量为6.5 mL。

2.4 稳定性实验

由表4、图 4可知，在1.2 mL 6%苯酚溶液，6.5 mL浓硫酸条件下，反应时间为10～60 min时，吸光度值呈现逐渐增加趋势；当反应时间为60 min时，吸光度出现最大值；之后，随反应时间增加，吸光度呈现逐渐下降趋势。由此，可以确定加入浓硫酸后的最佳反应时间为60 min，总体来说，反应时间内，吸光度变化较小，呈现比较稳定的变化趋势。

2.5 葡萄糖标准曲线的制作

通过对吸光度-葡萄糖浓度数据进行线性回归，得到吸光度值-葡萄糖浓度的线性回归方程：y=0.009x+0.002 3，线性相关系数R2=0.999 5。由表 5、图 5可知，吸光度与葡萄糖标准溶液浓度具有良好线性关系。

2.6 精密度实验

由表 6 可知，精密度实验的平均吸光度为0.298 4，标准偏差STDEV为0.003 43，相对标准偏差RSD为1.148%。表明该方法精密度较高，满足实验要求。

2.7 加标回收率实验

由表 7可知，5 份平行样测定的加标回收率为98.24%～100.29%，平均加样回收率为99.11%，标准偏差STDEV值为0.756 5，相对标准偏差RSD为0.763 3% ，实验结果满足加标回收率要求，表明该方法的准确度较好。

2.8 白芨样品中多糖含量测定

由表8可知，白芨多糖平行样品测定的多糖含量为65.5%～66.5%，平均多糖含量为66.08%，标准偏差STDEV值为0.376 4，相对标准偏差RSD为0.569 6% ，实验结果满足相关要求，方法重现性好。

3 讨论

由于苯酚是一种弱酸性的酚类物质，在空气中久置很容易吸水潮解或部分氧化为苯醌，导致纯度、有效浓度下降，进而影响显色反应，使测定结果有所偏离。因此，苯酚需要密封存放在干燥环境中，且现配现用；浓硫酸在反应中主要是将白芨多糖水解为单糖，并脱水生成糖醛衍生物。实验过程中，浓硫酸与样品反应若摇动不充分，使多糖水解为单糖不彻底也会影响多糖含量的测定结果。因此，为保证结果的准确性，加入浓硫酸后应充分摇匀，静置水解，以减小实验测定误差。

本实验以葡萄糖标准溶液为基准物质，确定了苯酚溶液、浓硫酸溶液的最佳用量及加入浓硫酸后适宜的反应时间。其最佳条件：标准对照物为无水葡萄糖，6%苯酚溶液用量为1.2 mL，浓硫酸用量为6.5mL，浓硫酸反应后适宜的静置时间为60 min，最合适的吸收波长为490 nm。在此条件下，吸光度与葡萄糖标准溶液浓度呈良好线性关系，线性回归方程为y=0.009x+0.002 3，线性相关系数R2=0.999 5。加标水平0.070 0 g时，平均加标回收率为99.11%，满足加标回收率对实验准确度的要求。由此可见，本实验分析条件简单，准确度较高，可靠性较强，显色反应比较稳定，灵敏度较高，实验结果重现性较好，可较好地推广应用于白芨多糖含量的常规检测。

参考文献

[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典[M]. 北京：化学工业出版社，2015.

[2] 张 寒，郝保华，徐花荣，等. 白及多糖的提取工艺的研究[J]. 陕西中医，2007，28（2）：223-225.

[3] 韩 丹，王艳萍，毕亚静，等. 白芨多糖提取方法的优选及其理化性质研究[J]. 药学实践杂志，2013，31（1）：35-37.

[4] 陶阿丽，金耀东，刘金旗，等. 中药白芨化学成分、药理作用及临床应用研究进展[J].江苏农业科学，2013，41（11）：6-9.

[5] 任华忠，何毓敏，杨 丽. 白芨化学成分其药理活性研究进展[J]. 亚太传统医药，2009，23（2）：134-140.

[6] 韩广轩，孙义华，罗曉静. 中药白芨药理作用及临床应用进展[J]. 药学实践杂志，2004，22（4）：215-217.

[7] 代建丽，周斯荻，刘铭轩，等. 白芨多糖的抑菌作用研究[J]. 安徽农学通报，2015，10（19）：19-21.

[8] 张龙霏，胡晶红，张永清. 白芨药理研究进展[J]. 中国现代中药，2014，16（1）：83-89.

[9] 商 晋. 白芨多糖提取工艺的研究进展及其在食品中的应用[J]. 现代食品，2018，4（1）：124-127.

[10] 刘光斌，黄 忠，黄长干，等. 天然植物白芨胶的功能及在化妆品中的应用[J]. 日用化学品科学，2005，5（8）：22-24.

[11] 张 颖，周岐新，赖 舒. 白芨多糖对骨髓造血功能的影响[J]. 中药药理与临床，2009，25（4）：35-37.

[12] 罗 磊，杨 帆，王 瑶，等. 白芨多糖的实验及应用研究[J]. 湖北中医杂志，2016，38（11）：69-72.

[13] 罗仕华，郑传胜，黎维勇，等. 白及多糖体外抗肿瘤实验研究[J]. 中成药，2014，36（1）：165-168.

[14] 贺国芳，丁伊玲，徐清霞，等. 白芨多糖预防免疫及化学性肝损伤[J]. 医药导报，2016，35（7）：714-717.

[15] 李裕波，林进令，刘志明. 白芨作为血管栓塞剂的应用[J]. 介入放射学杂志，2010，19（10）：835-838.

[16] 芮海云，吴国荣，陈景耀，等.白芨中性多糖抗氧化作用的实验研究[J].南京师大学报（自然科学版），2003，21（4）：94-98.

[17] 林福林，杨昌云，杨薇薇，等. 中药白芨的现代研究概况[J]. 中国医院药学杂志，2013，33（7）：571-573.

[18] 赵文昌，宋丽军，许健煌. 天然高分子白芨多糖在药物制备中的应用[J]. 今日药学，2010，20（3）：2-3.