草鱼肠道黏膜厌氧细菌的分离与鉴定

丰文雯 吴山功 郝耀彤 李文祥 李 明 邹 红 王桂堂

(1. 中国科学院水生生物研究所, 农业部水产养殖病害防控重点实验室, 淡水生态与生物技术国家重点实验室, 武汉 430072;2. 中国科学院大学, 北京 100049)

在鱼类生长发育过程中, 肠道内逐渐形成由好氧细菌、兼性厌氧细菌和专性厌氧细菌组成的动态稳定正常菌群[1,2]。研究证明肠道菌群在鱼类食物消化、营养吸收、疾病发生及防治上有重要作用[3]。因此, 近年来肠道微生物受到了越来越多的关注。基于分子生物学技术的方法, 例如DNA芯片技术[4]、荧光原位杂交技术[5]、宏基因组学技术[6]等, 能全面分析肠道微生物的种类、丰度信息。但多数肠道微生物是不可培养的, 尤其是肠道为厌氧和微厌氧的环境, 厌氧细菌对营养条件、培养环境等要求苛刻, 更难以培养, 而获得纯培养的细菌是进行微生物功能研究的关键一步。目前, 我们对鱼类消化道微生物的认识是不充分的。

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是全球水产养殖产量最大的一个品种, 2015年, 我国草鱼产量达到5.68×109kg, 占淡水水产品养殖总量的18.54%[7]。目前, 草鱼肠道微生物受到了广泛关注, 吴山功等[8]利用DGGE和T-RFLP技术研究了草鱼肠道内容物微生物种类及其与环境的关系, Tran等[9]利用高通量测序方法研究了草鱼肠道黏膜上的微生物类群,此外, 16S rRNA克隆文库也被用于草鱼肠道内容物微生物结构的研究[10]。这些研究都是基于分子生物学方法, 而草鱼消化道微生物的分离培养也有不少文献报道, 例如王微微等[11]采用羧甲基纤维素琼脂培养基筛选草鱼肠道中的纤维素降解细菌, Sugita等[12]采用7种不同的培养基培养草鱼肠道微生物,探究其与宿主草鱼之间的关系。以上结果都是在有氧条件下获得的, Trust等[13]1979年首次分离出草鱼肠道专性厌氧微生物, 主要为拟杆菌属(Bacteroides)、放线菌属(Actinomyces)、梭菌属(Clostridium)、梭形杆菌属(Fusobacterium)、消化链球菌属(Peptostreptococcus), 但他们的工作没有区分肠道黏膜和肠道内容物中的细菌。肠道黏膜上的微生物被认为是固有微生物[14], 固有微生物在维持个体正常生理活动中起重要作用[3]。

本研究以饥饿2个月的草鱼肠道黏膜为材料,采用传统厌氧微生物培养方法对草鱼肠道黏膜固有微生物进行了分离鉴定, 以期建立鱼类肠道厌氧微生物的培养方法, 为丰富草鱼消化道可培养微生物种类及其功能研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 实验培养基

BHIA脑心浸液培养基(青岛海博生物)的配制方法: 称取18.5 g脑心浸液培养基溶于500 mL去离子水, 加入0.1%刃天青(上海源叶生物)0.4 mL, 加热煮沸10min, 再加入5 g琼脂。待琼脂完全溶化后,加入0.25 g L-半胱氨酸(中国上海国药), 继续煮沸至红色消失, 转移至厌氧瓶(北京丰美)中, 121℃灭菌20min。

1.2 实验材料

实验草鱼来源于黄冈水产科学研究所实验基地, 体质量536.9 g, 体长37.90 cm。草鱼带回后于实验鱼房中饲养2个月, 期间不投喂饲料且每星期换水一次, 直至草鱼肠道排空, 菌群趋于稳定。

1.3 样品采集

将实验用鱼置于解剖盘中, 75%酒精擦拭体表3次, 用解剖剪沿肛门向上朝前呈弧形剪开, 在未取出肠道前按结构把草鱼肠道分为前肠、中肠和后肠, 并用细线进行结扎[15], 取出肠道, 剥离肠道外壁脂肪, 迅速转移至厌氧手套箱(Coy)中。待厌氧手套箱中H2和O2含量稳定后开始采集各肠段黏膜。用无菌解剖剪沿各部分肠道纵向剪开, 用PBS缓冲液(pH=7.2)漂洗3次, 最后用无菌解剖刀轻轻刮取0.5 g黏膜到10 mL离心管中[14]。

1.4 厌氧条件下细菌的分离与计数

向上述装有黏膜样品的离心管中加入4.5 mL PBS缓冲液, 充分混匀。吸取0.5 mL匀浆液到另一盛有4.5 mL PBS缓冲液的离心管中进行稀释, 作为10-2倍黏膜稀释液。按上述步骤, 制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8倍不同稀释度的肠道黏膜稀释液。取前肠稀释度为10-2、10-3和10-4, 中肠稀释度为10-3、10-4和10-5, 后肠稀释度为10-6、10-7和10-8的黏膜匀浆液涂布到BHIA培养基上, 每个稀释度重复3次, 涂布均匀后在28℃下厌氧培养48h[16]。最后从前肠、中肠和后肠培养基上各挑取约100个单菌落接种在液体BHIA培养基中, 28℃震荡培养48—72h。

1.5 可培养细菌DNA的提取和16S rRNA扩增

在无菌操作台中用2 mL注射器分别从300个厌氧瓶中吸取培养液1—2 mL离心管中, 每个离心管中装有2种规格的小磁珠(0.3 g 0.1 mm和0.1 g 0.5 mm),涡旋3min[17]。随后以菌液为模板, 用细菌通用引物27F、1492R和Go Taq Green Master Mix酶进行细菌16S rRNA扩增。PCR反应体系(终体积25 μL):80 ng DNA, 10 μmol/L引物, 9.5 μL无核苷酸水,12.5 μL Go Taq Green Master Mix酶。PCR反应条件: 94℃预变性5min; 94℃变性30s, 53℃退火30s,72℃延伸1min30s, 运行30个循环; 72℃延伸10min。扩增产物在1.0%琼脂糖凝胶上140V电泳30min后, 于凝胶成像系统中观察, 并用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒(北京艾德莱)对1500 bp的条带进行回收, 回收产物用pMD18-T载体(TaKaRa, 中国大连)连接转化到DH5α感受态细胞中, 涂布于57 mg/mL氨苄青霉素LB培养基上, 37℃培养10h。随机挑选转化子, 用载体通用引物M13(+)和M13(-)检测质粒是否插入成功, 对检测结果条带大小为1700 bp的单克隆送测序。

1.6 序列分析和系统进化树构建

采用DNAStar软件对测序结果进行拼接并去除载体序列[18], 然后将序列导入Ezbiocloud (www.ezbiocloud.net)数据库中比对。同时序列文件输入Ribosomal Database Project (RDP) Release11数据库进行序列分析[19]。通过Aligner序列比对, Complete Linkage Clustering聚类分析, 最后在Representative Sequence中选出每个聚类文件中的代表序列。用MEGA7.0[20]根据Kimura-two-parametermodel遗传距离模型[21], 采用邻接法(Neighbor-joining, NJ)[22]构建系统发育树。上述序列已上传至GeneBank数据库中, 序列登录号为MG428715-MG428988。

2 结果

2.1 草鱼肠道厌氧条件下可培养细菌的计数

不同肠段, 厌氧条件下可培养的细菌数量不同。前肠可培养细菌的数量是3.17×103cfu/g, 中肠可培养的细菌数量为1.63×104cfu/g, 后肠可培养细菌数量明显增多, 达到1.79×107cfu/g(表 1)。统计分析发现, 前肠与中肠可培养细菌数量没有显著差异(P＞0.05), 但前肠和中肠可培养细菌数量都与后肠可培养细菌数量差异极显著(P＜0.01)。

2.2 草鱼肠道厌氧条件下可培养细菌的分离与鉴定

本实验从前中后肠共挑取300个单菌落, 最终成功鉴定出274株细菌, 其中前肠97株, 中肠92株,后肠85株。经Ezbiocloud数据库比对, 共鉴定出15种细菌, 其中专性厌氧细菌4种, 占9.1%, 兼性厌氧细菌11种, 占90.9%(表 2、表 3)。比对分析结果表明, 草鱼肠道黏膜中优势菌株为气单胞菌属, 占79.9%, 其次拟杆菌属占7.7%, 希瓦氏菌属占5.5%,芽孢杆菌属占2.9%。

前肠微生物有7种(表 3), 分别为Aeromonas hydrophila、A.aquatica、A. encheleia、A. piscicola、Bacillus licheniformis、Citrobacter youngae、Shewanella xiamenensis; 中肠微生物类群主要有8种(表 2、表 3), 分别为Bacteroides luti、B. spaurosaccharolyticus、A. hydrophila、A. aquatica、A.encheleia、B. licheniformis、Pantoea ananatis、S.xiamenensis; 后肠微生物类群主要有12种(表 2、表3), 分别为B. luti、B. spaurosaccharolyticus、Cetobacterium somerae、Fusobacterium ulcerans、A.hydrophila、A. allosaccharophila、A. encheleia、B.licheniformis、P. ananatis、S. oneidensis、S. xiamenensis、F. acidificum。由此可知, 前肠中未分离到专性厌氧菌, 丰度最高的细菌是嗜水气单胞菌(78/274), 而A. piscicola(1/274)和C. youngae(2/274)仅仅在前肠出现。C. somerae(3/274)和F.ulcerans(1/274)是专性厌氧细菌, 只在后肠出现。

表 1 不同肠段厌氧细菌数量Tab. 1 Numbers of anaerobic bacteria in different intestinal segment (cfu/g)

表 2 草鱼肠道可培养专性厌氧细菌数目、种类及分布Tab. 2 Numbers, species and distribution of cultivable obligate anaerobes in intestine of grass carp

表 3 草鱼肠道可培养兼性厌氧细菌数目、种类及分布Tab. 3 Numbers, species and distribution of cultivable facultative anaerobes in intestine of grass carp

2.3 系统发育分析

选取15种细菌的代表性序列及其参考菌株序列, 另外以2个古细菌Methanobrevibacter smithii和Methanothermobacter marburgensis作为外类群序列构建系统发育树(图1)。在草鱼肠道黏膜中, 细菌的主要类型有变形菌门(Proteobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)。

3 讨论

3.1 厌氧情况下草鱼肠道黏膜可培养细菌数量情况

草鱼肠道有8个弯曲, 其长度是体长的两倍, 按结构可分为前、中、后肠3段[23]。本实验用厌氧方法培养了草鱼肠道不同肠段黏膜上细菌的种类和数量。实验结果显示草鱼前中后肠肠段黏膜上可培养的细菌数量分别是3.17×103、1.63×104、1.79×107cfu/g。该结果与Trust等[13]的研究有很大的差异, 他们在厌氧条件下培养的草鱼肠道内容物和黏膜前中后肠细菌总数平均值分别为9.0×106、4.3×107、7.7×108cfu/g。这种差异说明草鱼肠道内容物中也存在大量厌氧微生物, 同时, 所使用的培养基以及培养条件差异也可能造成数量差异。本研究使用了BHIA培养基, 而Trust等[13]运用了多种不同培养基。同时, 在Trust的研究中, 细菌培养温度为37℃, 而本次实验中为28℃。不同细菌最适生长温度不同, 超过其最适生长温度将导致细菌生长缓慢或不生长[24]。进一步分析发现, 在厌氧条件下,前肠微生物比中肠微生物少, 前肠和中肠微生物显著比后肠少, 前肠分离到的都是兼性厌氧微生物,专性厌氧细菌只在中后肠有发现, 后肠居多。研究表明, 鱼类或白蚁后肠为低氧或厌氧环境[25,26], 因此推测本实验结果可能是由于宿主消化道氧的分布不同造成的。

在鱼类肠道中, 好氧细菌、兼性厌氧细菌和专性厌氧细菌同时存在, 多数研究结果显示, 专性厌氧细菌的数量远远超过兼性厌氧细菌[27], 但是本实验通过厌氧培养的方法结果得到的专性厌氧细菌和兼性厌氧细菌的比例约为1鲶10。对于在厌氧条件下, 得到兼性厌氧细菌的数量远多于专性厌氧细菌的现象, 推测可能是以下两个方面的原因: 第一,某些专性厌氧细菌对营养条件要求苛刻[2], 在本次实验中, 并没有对培养基及培养条件进行优化, 因此单一的生长环境可能不能满足某些专性厌氧细菌的培养需求; 第二, 某些专性厌氧菌株生长较慢,在一些研究中, 专性厌氧细菌的培养时间为7d[28],而本实验中细菌培养时间为2d, 因此有些生长缓慢的细菌可能未被培养出来, 导致得到的专性厌氧细菌数量比较少。

图1 基于草鱼肠道黏膜厌氧细菌16S rRNA基因序列构建的系统发育树Fig. 1 Neighbor-joining phylogenetic tree of 16S rRNA gene sequences of intestinal mucosa anaerobes of grass carp

3.2 厌氧情况下草鱼肠道黏膜可培养细菌种类情况

鱼类肠道微生物的组成取决于营养状况。肉食性鱼类如青鱼肠道中的优势群落为蛋白酶产生菌, 这些细菌能将食物中复杂的蛋白质分解为各种氨基酸以利于营养物质的吸收, 而草食性鱼类如草鱼肠道中则多为纤维素酶或淀粉酶产生菌[29]。本实验结果表明, 草鱼肠道黏膜中存在大量的兼性厌氧细菌如气单胞菌属的种类。这与蒋燕等的结果是一致的, 他们发现饥饿状态下, 气单胞菌属的种类是草鱼肠道黏膜上的优势菌种, 能够分泌纤维素酶[30]。气单胞菌是常见的条件致病菌[31], 但是它在有机物发酵[32]、纤维素降解[30]和免疫调节[33]方面有重要作用, 因此气单胞菌可能在草鱼的消化道生理中发挥重要作用[8], 应该对其进行重新认识。本研究共发现3个属的专性厌氧微生物, Trust等[13]研究, 草鱼肠道中主要存在5种专性厌氧微生物, 分别为拟杆菌属、放线菌属、梭菌属、梭形杆菌属和消化链球菌属, 这可能与所用培养基不一致引起的,本研究使用BHIA培养基, 而Trust在此基础上, 还试用了TSA、RCM、PYGA、EYA、PYSC、BBA培养基, 其中, RCM为强化梭菌培养基, 有利于梭菌属细菌的生长。本研究中的拟杆菌属细菌经Ezbiocloud数据库比对发现与B. luti和B. paurosaccharolyticus的匹配值分别为89%和92%。在微生物分类中认为, 16S rRNA相似度小于95%时可能为不同属[34], 因此, 以上2株细菌是否属于拟杆菌属类细菌有待于进一步进行生理生化、进化地位及分子生物学的研究。此外, 本研究还在草鱼的后肠中发现了C. somerae, 鲸杆菌是淡水鱼类肠道生产维生素B12的主要细菌之一[28], 存在于草鱼后肠黏膜中,说明其是固有微生物之一, 能够长期定植于肠道表面, 持续提供维生素B12供机体利用。益生菌是一类提高宿主健康水平的有益微生物, 它们增强宿主抵抗有害微生物的能力, 提高食物转化率, 产生有机酸, 水产养殖过程中经常被作为饲料添加剂[35]。目前应用较多的为芽孢杆菌属细菌, 例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌等[36]。研究表明, 地衣芽孢杆菌能够增强鳊鱼机体免疫力和抗氧化能力[37], 同时分泌各种消化酶, 提高各种营养成分的利用率, 从而降低水产养殖成本, 提高经济效益[38]。

4 总结

本研究通过传统微生物培养方法, 成功分离出草鱼肠道黏膜专性厌氧细菌, 但是由于实验中仅运用了一种培养基, 而肠道的营养条件比较复杂, 不同厌氧微生物的营养需求不同, 因此本研究对厌氧微生物的认识还很肤浅, 没有能够全面揭示草鱼肠道黏膜厌氧微生物的组成和结构, 还需要优化实验条件以充分认识消化道厌氧微生物。

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