从鼠源到全人源单克隆抗体制备技术及改造策略的研究进展

施蕾，林洁平，廖淑珍，招春飞，刘华锋，潘庆军

(湛江市慢性肾脏病防控重点实验室，广东医科大学附属医院肾脏疾病研究所，广东 湛江 524001)

抗体是B淋巴细胞经抗原刺激而增殖分化为浆细胞后所产生的一种糖蛋白，主要介导体液免疫。单一B淋巴细胞系只产生针对一种特异性抗原决定簇的抗体，即单克隆抗体(简称单抗，monoclonal antibodies，mAbs)[1]。单抗具有结构均一、纯度高、特异性强、效价高、交叉反应少、制备成本低等优点。其生物学功能主要有[2]：(1)与抗原结合后募集免疫分子，如补体介导的细胞毒性作用(complement dependent cytotoxicity，CDC)、抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)等；(2)阻断配体-受体相互作用或引发细胞内信号通路，如诱导凋亡，这种机制主要依赖于其与抗原(配体或受体)结合功能。当前，40多种单抗已被批准使用于临床治疗自身免疫性疾病、肿瘤和移植等，且有大量的单抗正在研发[3]。

1 全人源单抗的制备技术

1.1 人源化小鼠

1975年Kohler和Milstein[4]通过小鼠杂交瘤技术获得了单抗。鼠源单抗会诱发患者机体的免疫应答，使其被快速清除，故治疗效果较差。人源性单抗可减少鼠基因序列引起的免疫反应，提高治疗的效能及安全性[5]。随后开启了人源化单抗制备的历史。1977年，Abgenix公司(美国)使用转基因技术制备出含人免疫球蛋白基因的转基因小鼠(XenoMouse)[6]。2001年，Karpas等[7]从人多发性骨髓瘤细胞中筛选出一株细胞株，其能在体外保持稳定的扩增能力，被命名为Karpas707细胞，拟用于融合人B细胞，进而制备全人源单抗，但至今相关报道甚少。全人源单抗作为一个新兴技术正处于上升期，受到国内外医药领域研究者广泛关注[8]。据报道，与抗体库平台技术相比，转基因小鼠平台技术在开发全人源抗体中更具优势，成为目前最具有优势的抗体药物研发平台。Medarex公司(隶属于百时美施贵宝)的 HuMAb-MouseTM与Abgenix公司(隶属于安进)的XenoMouse技术是目前最为成熟的转基因小鼠技术。在此基础上，Regeneron 的科学家设计了VelocImmuneTMmouse技术平台进行抗体药物的筛选，并且在此平台上进一步构建了“共有轻链小鼠”(common light chain mouse)，利用这种小鼠产生的抗体的亲和力较高[9]。但产生全人源单抗的转基因小鼠的研发周期长，需要投入巨额的研发基金，迄今为止国内的转基因小鼠核心技术平台较少。目前，已有数种全人源单抗制备技术[10]。与此同时，针对治疗性单抗的改造可增强其治疗的安全性和有效性，如优化单抗亲和力成熟、改变单抗糖基化水平等。

1.2 噬菌体展示技术

1985年，Smith[11]第一次将外源基因插入丝状噬菌体f1的基因III，使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面，创建了噬菌体展示技术。随后，Scott等[12]提出表面展示系统，Chiswell等[13]在此基础上提出了噬菌体展示系统。此后30年间，研究者们在微流体噬菌体展示技术(microuidic-based phage display)的基础上进行进一步研究开发，使其具有简单、高效和低廉的优点[14]。噬菌体展示技术用于单抗的制备，仅需获得免疫球蛋白的基因序列，即可制备相应的抗体片段[15]；因此，可快速筛选单抗，避免了传统杂交瘤方法的限制性和周期长等问题。根据使用的噬菌体类型不同，噬菌体展示系统被分为：丝状(M13)噬菌体展示系统[16]、T7噬菌体展示系统[17]、lambda[18]或T4[19]噬菌体展示系统。目前，噬菌体抗体库技术已经十分成熟，可筛选出高特异性、亲和力强的抗体基因序列，进而制备全人源抗体。如雅培公司研发的抗肿瘤坏死因子(TNF)全人单抗Humira(修乐美)，用于治疗关节炎等[10]。

1.3 酵母展示技术

1997年，Boder与Wittrup[20]首次建立酵母展示系统，并且用遗传学方法改进酵母菌株。酵母展示技术提高了细胞表面蛋白结合的亲和力和稳定性，最先使用于抗体的亲和力成熟[20-21]。与噬菌体相比，酵母的颗粒足够大，以致其可以使用流式细胞技术和荧光激活细胞分选进行筛选和分离[22]。大多数酵母细胞表面展示系统运用经典的糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)锚定蛋白、凝集素和絮凝剂[23]。酵母展示系统常被用于scFv库、Fab库、IgG库及ZZ结构域等抗体库的构建[24]。

1.4 哺乳动物细胞表面展示技术

哺乳动物细胞是表达具有天然活性蛋白的重要宿主，Akamatsu等[25]利用哺乳动物细胞进行抗体的展示及筛选，从而获得特异性抗体。中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞是用于真核基因表达的最成功的哺乳动物细胞，是目前在生物工程上广泛使用的哺乳动物细胞[26]。与噬菌体展示技术相比，外源蛋白更易在CHO细胞中合成并且分泌到培养基；重组蛋白能够正确折叠、修饰、组装多亚基蛋白并且其理化性质、生物学性质几乎与天然蛋白相似[27]。但外源基因在CHO表达系统中比在酵母展示系统中的表达效率低且重组蛋白的生产成本高，故通过改进CHO细胞表达技术，如调控表达技术、优化载体和基因、改造宿主细胞等，从而提高外源基因的表达效率，这在生物技术的发展中具有很高的应用价值[28]。

1.5 单个B细胞分选技术

近年，单个细胞分选技术引起广泛关注。Hu等[29]用CD19、IgG和HA特异性BCR标记联合筛选抗原特异性记忆B细胞，该技术有效地增加了高亲和力抗原特异性全人源单抗的获取。Smith等[30]发现了一种快速制备全人源单抗的方法，即将单细胞RT-PCR与嵌套式PCR组合获取抗体的基因信息。与噬菌体展示相比，该方法可提高抗体的有效性和产量。目前，基于该技术已制备出抗流感、抗炭疽病毒和抗肺炎球菌全人源抗体。另外，Nogales-Gadea等[31]运用一种更简单、可直接制备全人源单抗的技术即，运用EB病毒感染人记忆B细胞同时加入Toll样受体9(Toll-like receptor 9，TLR9)激动剂的方法，制备全人源单抗：首先，分离外周血PBMC，运用分选技术获得B细胞，再用EB病毒感染使之永生化，在感染过程中加入TLR9激动剂激活，持续培养后，筛选最优活性的B细胞，随后运用PCR技术进行测序和克隆[32]。

近年来，研究者们运用微流体PCR和DNA测序技术可从大量细胞中分析单个细胞，Ramsköld等[33-34]开发出一种的Smart-Seq基因测序法，可显著改善转录组的覆盖范围，精确分析临床相关单细胞中的基因表达情况。基于此技术，Picelli等[35]开发出与Smart-seq相比更经济、高效的Smart-seq2技术[36]。

目前，单细胞抗体纳米孔(SCAN)技术是第一个能够定量单个B细胞分泌抗体水平的技术，可直接检测分泌的自身抗体，明确其抗原特异性和产生自身抗体的细胞，具有高通量、高敏感性和高特异性。Esfandiary等[37]运用SCAN技术检测来自单个B细胞的同型特异性抗SSA/Ro60和抗SSB/La的自身抗体，并可定量B细胞分泌两种抗体的水平。

2 全人源单抗的改造策略

当前，市售治疗性单抗多属于IgG类(IgG1和某些IgG2和IgG4亚型)。IgG其发挥功能主要依赖Fab段的抗体中和作用、Fc介导的补体激活作用(诱发补体依赖的细胞毒作用，CDC)、活化的FcγR(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa)诱导ADCC以及新生儿Fc受体(FcRn)介导的半衰期改变等。人IgG以重链的差异(γ1、γ2、γ3、γ4)分为4个亚型：IgG1(60% ～ 70%)、IgG2(15% ～ 20%)、IgG3(5% ～ 10%)、IgG4(4% ～ 6%)。目前，研究者们通过以下几个方面对单抗的疗效进行优化。

2.1 亲和力成熟

通过优化单抗的亲和力，能相应地提高单抗的有效性，减少其不良反应。研究者将一些构建抗体库的方法应用到抗体库技术中以便产生更大库容量的突变抗体库，或模拟体内亲和力成熟的显著突变或热点突变基因构建小容量库，从而筛选出高亲和力的特异性抗体[2, 38]。

2.2 糖基化修饰

糖基化修饰在抗体的功能调节中起着关键作用[39]。大部分IgG分子仅在每个Fcγ2区域Asn-297存在一个保守的N-糖基化修饰位点，约20%在IgG可变区有第二个N-糖基化位点，所有位点都位于重链[40]。糖基化能够影响Fc段的结构和稳定性，而Fc 糖基化修饰能够调节 IgG 的效应功能，包括ADCC、CDC以及半衰期。因此，IgG的Fc糖链对抗体与各种受体的最佳结合、抗体对病原体的有效清除，以及治疗性抗体的临床应用都是必不可少的[41]。

正常人IgG的Fc寡糖主要为核心岩藻糖基化的复杂双天线型，多因为末端糖的半乳糖基化和唾液酸化而产生异质性。核心岩藻糖缺失可显著增强IgG的ADCC，原因在于核心岩藻糖基化缺失的抗体与FcγRIIIA的亲和力显著增强[42]。但在一些治疗应用上，减少或消除ADCC活性也是必要的。Gong等[43]发现抗-CD20单抗，IgG4非岩藻糖基化水平 < 30%，IgG4抗体与其受体的结合力是最弱的。这表明，非岩藻糖基化IgG4能够降低其效应功能，增加单抗的治疗效果。末端半乳糖基化也显著影响IgG功能，半乳糖残基的缺失与类风湿性关节炎的发病相关[44]，Liu等[45]认为在单抗中较低水平的末端半乳糖能够降低CDC活性。末端唾液酸化在哺乳动物表达系统产生的单抗主要有两种类型：N-乙酰神经氨酸(NeuAc)和N-羟乙基神经氨酸(NeuAc), 后者是人类唾液酸的形式。Scallon和Anthony等[46-47]发现提高IgG Fc的唾液酸含量能够降低ADCC的活性，使其与细胞表面抗原结合活性降低。此外，人类IgG中还存在少量无岩藻糖Fc糖链(含或不含二等分乙酰葡糖胺)和少量高甘露糖结构。Anthony等[47]发现含有末端乙酰葡糖胺基化的IgG可与血清甘露糖结合蛋白结合并激活补体。Zhou等[48]用甘露糖抑制剂(kifunensine)处理CHO细胞，干预某血管瘤单抗糖链的合成，发现高甘露醇处理可提高单抗的疗效。

2.3 Fc受体改造

研究者发现Fc受体与多种抗体依赖性疾病相关，是治疗性抗体药物在治疗过程中的关键靶点，单抗的Fc段能够通过介导其效应功能提升其功效[49-50]。目前，市售治疗性单抗多为IgG1亚型，其Fc段效应功能较高，然而，有着功能多样性的IgG1同型和IgG亚型通过增加稳定性，如将两种抗体同型的氨基酸序列进行交换(cross-isotypes)，以提高临床安全性，减少不良事件的发生[43, 51]。

在IgG亚型中，虽然IgG4含量最少，但IgG4型抗体最具生物学独特性[52]，其铰链区独特的结构决定其缺乏激活补体[53]和结合Fc受体的能力[54]，在不需要Fc段效应功能的治疗性抗体开发方面是主要选择，如自身免疫性疾病系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎等[55]。故用非岩藻糖基化IgG4同型抗体替代IgG1亚型单抗，能够增加单抗的临床疗效[43]。但Bruhns等[54]发现，IgG4抗-CD28抗体用于临床试验时，在志愿者体内发现IgG4复合物与FcγRIIA及FcγRIIIA结合的沉积物，可引起多器官功能障碍。这意味着，治疗性抗体也存在潜在的风险，需要针对性的修饰或改造，以降低或避免这种风险。