益生菌干预对运动大鼠胃肠激素与AQP4表达的影响

莫伟彬，杨衍滔，郭艳菊，周彩华，邵晓云

(1. 广西师范大学体育学院，广西 桂林 541004； 2. 药用资源化学与药物分子工程国家重点实验室 广西 桂林 541004； 3. 桂林医学院人体解剖学教研室，广西 桂林 541004)

胃肠运动受肠道神经系统和体液调节的影响，而长时间的激烈运动或高强度运动应激常引起肠道屏障功能受损，肠道微生态系统紊乱[1]。益生菌是人和动物等宿主有益的微生物。在2001年FAO/WHO(联合国粮农组织/世界卫生组织)将益生菌定义为“当机体从膳食中摄入足够的量，能够对机体或宿主产生有益作用的活性微生物”[2]。Del等[3]研究表明，益生菌能够耐受机体组织内胃液、胆汁和胰脏等分泌物黏附于肠道上皮细胞的活性微生物。最近研究还发现，益生菌在机体内具有改善胰岛素敏感性与降胆固醇[4]、增强肠道的消炎抗菌、抗氧化和提高肌肉的抗疲劳能力[5]等作用。目前通过益生菌干预运动大鼠胃肠道调节激素和水通道蛋白-4 (aquaporim4, AQP4) 变化的研究较少。本研究建立6周的力竭运动大鼠模型，观察益生菌对运动大鼠胃肠道功能的影响，为探讨高强度运动时益生菌对机体消化系统的影响提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

40只SPF 级SD雄性大鼠，10周龄，体重(250±10) g，购自桂林医学院实验动物中心【SCXK(桂)2013-0001】。饲养和实验均在桂林医学院实验动物中心屏障环境中进行【SYXK(桂)2013-0001】。饲养期间给予大鼠标准饲料及洁净饮用水(均由桂林医学院实验动物中心提供)。饲养环境温度20 ～ 26℃，湿度60%± 5%。所有操作均符合实验动物伦理学要求 (伦理审批号：GLMC201703049)。

1.1.2 益生菌

研究材料为益生菌固体配剂(每100 g益生菌中含长双歧杆菌1.2 × 1010CFU、两歧双歧杆菌1.9 × 1010CFU、嗜热链杆菌3.2 × 109CFU、嗜酸乳杆菌4.6 × 109CFU、德氏乳杆菌保加利亚亚种3.0 × 109CFU)，购于哈尔滨美化生物技术股份有限公司 (批号：G20110198)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及益生菌灌服量

将大鼠随机分为安静对照组(NC)，运动对照组(ME)，安静给药组(NCY)，运动给药组(MEY)。动物适应性饲养3 d后，运动对照组和运动给药组进行适应性训练1周。每天训练前30 min采用专业灌胃器灌胃1次，其中安静给药组和运动给药组每日灌胃新配制的益生菌10.0 mL / (kg·d)，其中益生菌浓度为107CFU/mL[5]。对照组灌服等量生理盐水，连续灌服给药6周，1次/日，直到实验结束。

1.2.2 动物模型与取材

运动训练模型按Bedford[6-7]方案进行设计，设定大鼠运动跑台的速度为19.3 m/min(76%的VO2max左右)，保持此强度至力竭，其中跑台坡度为5o，每天训练1次，每周6 d，共6周。力竭判断标准为大鼠四肢伏地，声光电刺激不能继续运动。6周力竭训练结束后大鼠空腹24 h， 用乌拉坦溶液(浓度20%)按3 mL/kg腹腔注射麻醉后解剖，抽取主动脉血液5 mL，放入离心管中，待放2 h后，经3500 r/min离心10 min (4℃)，取血清于EP管中，标记，-80℃冰箱中保存。取血后迅速解剖取胃和肠，胃沿胃大弯处剪开分为二份，肠组织主要取结肠部分，然后用冰冻的生理盐水清洗三次后，滤纸吸干，包裹后放入-80℃冰箱中待测。

1.2.3 大鼠激素指标测定

采用酶联免疫法测定胃肠激素指标,大鼠血清ghrelin(生长激素酰化肽)试剂盒(货号：hj-C1989); PYY(酪酪肽)试剂盒(货号：hj-C8241); CCK(胆囊收缩素)试剂盒(货号：C3558)、GLP-1(胰高血糖素样肽)试剂盒(货号：C1402); MTL(胃动素)试剂盒(货号：C1749)和GAS(胃泌素)试剂盒(货号：C1748)均由上海常斤生物科技有限公司提供,测定方法严格按照说明方法进行。测定仪器为酶标测定仪(型号：M1000，TeCAn，瑞士)。

1.2.4 大鼠胃肠组织AQP4 mRNA及蛋白表达的测定

(1)引物合成

大鼠AQP4与β-actin基因引物设计见表1(由上海生工设计合成)。

表1 引物序列与扩增长度Table 1 Primer sequence and amplification length

(2)AQP4 mRNA检测

首先，取胃肠组织各100 mg匀浆，各组织的测定严格按照Trizol说明提取总RNA；然后按Fermentas公司生产的反转录RT-PCR试剂盒说明书取胃肠组织各5.5 μL RNA合成cDNA，其条件:室温反应10 min；42℃，45 min；95℃，5 min；4℃，5 mi)。取各组织cDNA 2.5 μL，上下游引物各0.5 μL，去离子水10 μL，PCR Master Mix 10 μL进行PCR扩增转录，胃肠组织转录条件均为：95℃预变性3 min；95℃变性45 s；55℃退火30 s；40个循环，72℃延伸5 min。最后，各取10 μL转录产物于1.5%的琼脂糖凝胶模板电泳(110 V, 60 min)。用凝胶成像系统(Bioserss-l805型, BD公司, 美国，)分析其灰度值，其比值均采用胃肠组织AQP4 /β-actin来表示。

(3)Western blot 法

取大鼠胃肠组织各200 mg经剪碎、液氮研磨并充分裂解后，离心(10 000 rpm/min) 5 min取上清液，胃肠组织均用BCA法测定浓度，各组织以25 μL上样，经10%的SDS-PAGE电泳后，将蛋白转移至PVDF膜上，恒定电流14 V，100 mA，转印2 h后，封闭过夜，加入AQP4、β-Actin一抗过夜，加入二抗孵育1 h，ECL显色和曝光。用凝胶成像系统对胃肠组织AQP4与β-Actin蛋白条带的灰度扫描并用比值表示。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 益生菌对运动大鼠胃肠激素含量的比较

ME组大鼠血清ghrelin和PYY含量均高于NC组(P< 0.01)，而ME组大鼠血清CCK、GLP-1、MTL和GAS含量均低于NC组 (P< 0.01)；NCY组大鼠血清ghrelin、PYY均低于ME组 (P< 0.01)但高于NC组，而CCK、GLP-1、MTL和GAS含量均高于ME组 (P< 0.01)；MEY组大鼠血清ghrelin高于NC组 (P< 0.05)而低于ME组 (P< 0.01)；MEY组大鼠血清PYY的含量低于ME组 (P< 0.01)；MEY组大鼠血清CCK含量低于NC组 (P< 0.05)而高于ME组 (P< 0.05)；MEY组大鼠血清GLP-1、MTL和GAS含量均高于ME组 (P< 0.01)。见表2。

表2 益生菌对运动大鼠胃肠激素影响的比较Table 2 Comparison of effect of probiotics on the gastrointestinal hormones in the rats during n=10, pg/mL)

注：与NC组比较,“a”示P< 0.05，“b”示P< 0.01；与ME组比较,“c”示P< 0.05；“d”示P< 0.01。

Note. Compared with the NC group, “a” meansP< 0.05, “b” meansP< 0.01. Compared with the ME group, “c” meansP< 0.05, “d” meansP< 0.01.

2.2 大鼠胃肠组织AQP4 mRNA表达

ME组大鼠胃肠组织AQP4 mRNA表达均低于NC组 (P< 0.01或P< 0.05)；NCY大鼠胃肠组织AQP4 mRNA表达均高于ME组(P< 0.01)；MEY 组大鼠胃肠组织AQP4 mRNA表达均高于ME组(P< 0.01或P< 0.05)，但低于NC组，其中MEY 组大鼠胃肠组织AQP4 mRNA表达与NC组比较差异无显著性。见图1、表3。

2.3 大鼠胃肠组织AQP4蛋白表达

ME组大鼠胃肠组织AQP4蛋白表达均低于NC组(P< 0.01)，NCY和MEY组大鼠胃肠组织AQP4蛋白表达均高于ME组(P< 0.01)。见图2、表3。

图1 各组大鼠胃肠组织AQP4 mRNA 产物电泳图Figure 1 Electrophoresis of AQP4 mRNA product in gastric and intestine tissues each group of rats

图2 各组大鼠胃肠组织AQP4蛋白表达Figure 2 AQP4 protein expression in the stomach and intestinal tissues in each group of rats

组别Groups胃水通道蛋白-4 mRNA Stomach AQP4 mRNA肠水通道蛋白-4 mRNA Intestinal AQP4 mRNA胃水通道蛋白-4蛋白 Stomach AQP4 protein肠水通道蛋白-4蛋白Intestinal AQP4 protein安静对照组NC1.32±0.091.40±0.102.16±0.181.96±0.05运动对照组ME0.45±0.13b0.91±0.06 a1.31±0.15 b1.07±0.16b安静给药组NCY1.38±0.07d1.45±0.16 d2.19±0.16d1.98±0.13d运动给药组MEY1.27±0.10d1.29±0.21 c1.96±0.05d1.91±0.16 d

注：与NC组比较，“a”示P< 0.05，“b”示P< 0.01；与ME组比较，“c”示P< 0.05；“d”示P< 0.01。

Note. Compared with the NC group, “a” meansP< 0.05, “b” meansP< 0.01. Compared with the ME group, “c” mensP< 0.05, “d” meansP< 0.01.

3 讨论

胃肠道作为机体内的内分泌器官，存在着大量的微生物菌群，肠道细菌量达到1014个以上，在机体内具有相互依赖、制约和维持胃肠道平衡[8]。有研究表明，肠道正常菌群受到破坏时，易引起菌群失调，导致便秘[9]、胃肠道功能失调或肿瘤[10]等各类胃肠道疾病。益生菌是人和动物等宿主有益的微生物，对保护机体组织中胃和肠道方面具有重要的作用。Schwartz等[11]和Barbara等[12]研究表明，益生菌能够调节肠道炎症患者的肠道菌群平衡，稳定肠道黏膜的屏障和减少胃肠道菌群移位的发生。Jensen等[13]证明了益生菌与消化性溃疡和慢性胃炎中的幽门螺杆菌存在拮抗作用，并且能够抑制幽门螺杆菌的黏附和修复胃黏膜。因此，研究益生菌干预运动大鼠胃肠道激素具有重要的意义。

胃肠道激素ghrelin、PYY肽、CCK、GLP-1、MTL和GAS对机体的胃肠道调节具有重要的生理作用[14-15]。Wu等[16-17]研究表明，ghrelin具有保护肠道功能屏障和降低乳酸的堆积等功能。Ashby等[18]和Sloth等[19]研究发现，PYY是抑制食欲作用的多肽，在机体内具有调节能量、减缓肠胃的排空和胃酸分泌的增多。CCK属CCKRs中G蛋白偶联受体的家族成员，具有调节肠胃功能和抑制食欲的作用[20-21]。GLP-1属肠源性肠促胰岛素激素，具有抑制胃排空和增加肠道葡萄糖的转化[22]。MTL是由22个氨基酸组成的多肽，具有增加胃肠动力的收缩和刺激胃蛋白酶的分泌[23]。GAS是重要的胃肠道调节因素，具有加快胃肠道蠕动、刺激胃酸分泌、促进胃内因子和胆汁的分泌等作用[23-24]。胃肠道调节激素的含量能够反映胃肠道功能的状态，调节激素的正常分泌能够保证胃肠道的消化、吸收和排泄等，以免发生胃肠道功能失调。常保荣等[25]研究发现,有氧运动能够提高大鼠血清ghrelin含量，提高大鼠胃排空速率，改善身体成份。有研究表明，节食减肥引起机体ghrelin水平升高，PYY和GLP-1的含量受到抑制[26-27]。运动结合饮食干预后胃肠调控激素ghrelin水平升高，而PYY水平不变[28]。王茹等[14]对肥胖青少年进行为期4周的高住低练与膳食干预后，实验组青少年胃肠道调控激素ghrelin、PYY和GLP-1含量升高，CCK含量有所降低。蒋波等[29]在窒息新生儿饮食中添加益生菌后发现， 窒息新生儿补充益生菌后体内的激素MTL和GAS含量逐渐恢复到正常的水平，同时表明添加益生菌有利于新生儿肠道的恢复。本研究发现，力竭运动后大鼠血清ghrelin和PYY含量均显著升高，这与Martins等[30]研究结果一致，提示力竭运动使机体糖原的消耗导致能量代谢负平衡有关，加速了胃的排空。通过补充益生菌溶液后发现，大鼠血清ghrelin和PYY含量均高于安静对照组但与运动组比较有一定的差异性，提示这可能是由于益生菌溶液保护胃肠道在运动中发生异常，防止胃肠道功能紊乱。研究还发现，力竭运动后大鼠血清CCK、GLP-1、MTL和GAS含量均低于安静对照组。而CCK属抑制食欲因子，血清中CCK含量的下降表明胃肠分泌量下降，机体能量消耗加大，食欲增强[7]。力竭运动中GLP-1和MTL含量的下降这与郑必海等[31]研究结果一致，这可能是由于力竭运动引起机体内氧的缺乏，GLP-1和MTL分泌量增加，加速了胃肠动力的排空和能量的消耗，易引起胃肠道黏膜损伤。GAS的下降这可能是由于胃酸分泌增多和能量的消耗存在一定的关系。通过补充益生菌溶液后发现，大鼠血清CCK、GLP-1、MTL和GAS含量均有上升的趋势，逐渐恢复到安静时的水平。提示益生菌溶液可能起到调节胃肠激素，使胃肠动力和胃液分泌等功能趋于正常，保护胃肠道损伤和运动紊乱。但胃肠道调节激素机制还有待深入研究。

水通道蛋白-4(AQP4)属水通道蛋白(AQP)特异性转运水跨膜蛋白家族成员之一，它的表达主要存在于胃壁和结肠组织中[32]；具有维持胃肠道水液代谢平衡、免疫调节和细胞迁移等生理功能[33]。Hardin等[34]研究发现，大鼠和人体中的结肠损伤都与AQP4表达下调和AQP4参与了结肠液体的分泌相关。杨鹏等[35]研究发现，活动性胃炎和胃黏膜腺体萎缩与AQP4表达下调有关。赵琴等[36]研究表明，胃和十二指肠有炎症和腹泻时，AQP4表达下降，胃肠道水的重吸收减少，胃肠黏膜的电解质失调，但通过补充藤黄后胃肠道AQP4表达升高，胃肠道的通透性增加。本研究发现，力竭运动后大鼠胃肠组织AQP4 mRNA和蛋白表达均低于安静对照组，提示长时间的力竭运动可能导致大鼠胃肠组织黏膜功能受损和胃肠道调节激素分泌异常，从而引起胃肠道水液代谢失调。通过补充益生菌溶液后发现，大鼠胃肠组织AQP4 mRNA和蛋白表达均增加，提示AQP4表达在益生菌的作用下增加可能参与了胃肠水代谢的过程，调节了胃肠激素分泌，保证了胃肠道功能的正常。但益生菌溶液在不同强度运动方式下对机体产生的机制还有待深入研究。