Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1 mRNA在神经胶质瘤中表达及临床意义

王春辉 刘乃杰 谷洁冰 唐 栋 韩雪梅 王立波

(吉林省人民医院神经外科，吉林 长春 130021)

长期氧化应激与包括神经胶质瘤等多种疾病的发生高度相关〔1～3〕。Kelch样环氧氯丙烷(ECH)相关蛋白(Keap)1-核因子E2相关因子(Nrf)2/抗氧化反应元件(ARE)是目前发现的最重要抗氧化应激通路之一，在维持机体氧化-抗氧化生理平衡和防御氧化损伤等方面发挥着极为重要的作用〔4〕。Keap1和Nrf2作为氧化应激的关键调节者，在神经胶质瘤中的表达值得关注。Nrf2在神经胶质瘤中呈差异性表达，并与肿瘤分级及生存期等临床特征相关〔5,6〕。然而，Keap1 mRNA在神经胶质瘤中的表达变化未见文献报道。本研究通过实时荧光定量PCR的方法对神经胶质瘤中Keap1 mRNA进行定量检测，并分析其与临床病理分级的相关性，以探讨Keap1 mRNA的表达在神经胶质瘤发生发展的作用。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集吉林省人民医院神经外科神经胶质瘤手术患者43例，男25例，女18例，平均年龄(53.7±16.2)岁，中位年龄54岁。手术标本均经组织病理学确诊，置于冻存管中，加入RNA保存液浸泡组织，液氮速冻，-80℃冰箱保存。样本临床病理分级：Ⅰ～Ⅱ级25例，Ⅲ～Ⅳ级18例。31例对照标本来源于颅脑外伤减压术患者，男18例，女13例，平均年龄(53.1±11.3)岁，中位年龄54岁。两组年龄、性别构成差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2主要仪器及试剂 超微量紫外分光光度计(NANODROP公司，美国)，ABI7500 实时荧光定量PCR仪(ABI公司，美国)。TRNzol总RNA提取试剂、反转录试剂盒和SYBR Green(天根公司，北京)。

1.3引物设计 根据NCBI GenBank数据库公布的人类Keap1 mRNA全长序列(登录号：NM_012289)，采用Primer3软件设计引物：Keap1上游:5′-CCAACCGACAACCAAGACC-3′,下游5′-CTCAGTGGAGGCGTACATCA-3′。β-actin上游：5′-CCCAGCCATGTACGTTG CTAT-3′，下游：5′-TCACCGGAGTCCATCACGAT-3′。引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。

1.4实时荧光定量PCR检测 取出组织，称重50 mg，匀浆机匀浆，加入1 ml TRNzol，按照操作说明提取RNA，超微量紫外分光光度计检测RNA纯度和浓度。运用随机引物和M-MLV反转录酶将500 ng RNA反转录成cDNA。建立定量PCR反应体系：2×SYBR Green 10 μl，cDNA 2 μl，上游和下游引物(10 μmol/L)各0.2 μl，加无RNA酶水至20 μl。ABI7500 实时荧光定量PCR仪上进行反应，反应条件如下：95℃预变性1 min，95℃ 5 s，60℃ 30 s， 40个循环后95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s进行熔解曲线分析。每个样本3个复孔，以β-actin作为内参，采用2-ΔCt法分析样本中Keap1 mRNA相对含量。

1.5统计学方法 采用SPSS11.0统计软件进行t检验。

2 结 果

熔解曲线波形一致，波峰单一锐利，无非特异性波峰出现，表明引物较好，无非特异性扩增，结果可靠。神经胶质瘤组中Keap1 mRNA表达量(0.59±0.64)显著低于对照组(1.09±0.93；t=2.57，P=0.01)。神经胶质瘤Ⅲ～Ⅳ级Keap1 mRNA表达量(0.37±0.32)显著低于Ⅰ～Ⅱ级(0.75±0.77；t=2.20，P=0.04)。Keap1 mRNA表达水平与神经胶质瘤患者年龄(≥44岁，n=23，0.53±0.45；<44岁，n=20，0.67±0.82)和性别(男0.56±0.59，女0.64±0.72)无明显相关性(t=-0.68，P=0.50;t=-0.39,P=0.70)。

3 讨 论

氧化应激是指在遭受各种外界有害刺激时，机体内产生大量氧化中间产物，如活性氧自由基和活性氮自由基，超出清除能力，氧化系统和抗氧化系统失衡，导致组织器官损伤〔4,7〕。Nrf2是机体抗氧化应激过程中的重要转录因子，生理状态下，Nrf2位于细胞质内，与接头蛋白Keap1结合形成异二聚体，使Nrf2被迅速降解。应激状态下，Nrf2与Keap1解离后转入细胞核内，通过与ARE相互作用，活化抗氧化酶和蛋白，发挥抗氧化、抗炎和抗肿瘤作用。

Nrf2在神经胶质瘤中高表达，与肿瘤分级和生存期等临床特征相关〔5,6〕。低表达Nrf2可通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路抑制神经胶质瘤细胞增殖、血管形成，促进细胞凋亡和替莫唑胺诱导的细胞自噬〔8～10〕。探索靶向Nrf2药物成为研究的新方向，例如，桧醇可通过抑制Nrf2表达减少胶质瘤干细胞自我更新、侵袭、迁移和克隆形成等肿瘤特性，发挥抗肿瘤作用〔11〕。Fan等〔12〕报道，过表达Nrf2或低表达Keap1能够加快胶质瘤细胞增殖和肿瘤形成，抑制细胞程序性死亡，例如铁死亡。激活Keap1-Nrf2/ARE信号通路能够上调胱氨酸谷氨酸转运蛋白的表达，促进谷氨酸分泌，从而影响肿瘤微环境。全反式视黄酸可通过下调Keap1的表达抑制胶质瘤细胞生长，使细胞周期阻滞于G0/G1期，并增强替莫唑胺诱导的细胞自噬〔13〕。

本研究提示Keap1 mRNA的表达不仅与神经胶质瘤的发病有关，而且与肿瘤恶性程度有关。关于Keap1 mRNA低表达的原因，有研究显示胶质瘤患者Keap1启动子区CpG存在高度甲基化，高甲基化患者的无进展生存期更短〔14〕，表明Keap1的表观遗传调控可能参与神经胶质瘤的发病，其确切机制有待进一步研究。若探明其分子机制，将有望针对Keap1开发安全有效的药物治疗神经胶质瘤。

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4胡流芳,王 迎,任汝静,等.Keap1-Nrf2/ARE信号通路的抗氧化应激作用及其调控机制〔J〕.国际药学研究杂志,2016；43(1):146-52,166.

5Tsai WC,Hueng DY,Lin CR,etal.Nrf2 expressions correlate with WHO grades in gliomas and meningiomas〔J〕.Int J Mol Sci,2016;17(5):E722-5.

6王 波,张协军,陈保东,等.不同级别脑胶质瘤细胞中Nrf2、MGMT表达的临床意义及其相关性分析〔J〕.深圳中西医结合杂志,2016;26(8):1-4.

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10Jia Y,Wang H,Wang Q,etal.Silencing Nrf2 impairs glioma cell proliferation via AMPK-activated mTOR inhibition〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2016;469(3):665-71.

11Ouyang WC,Liao YW,Chen PN,etal.Hinokitiol suppresses cancer stemness and oncogenicity in glioma stem cells by Nrf2 regulation〔J〕.Cancer Chemother Pharmacol,2017;80(2):411-9.

12Fan Z,Wirth AK,Chen D,etal.Nrf2-Keap1 pathway promotes cell proliferation and diminishes ferroptosis〔J〕.Oncogenesis,2017;6(8):e371.

13Shi L,Li H,Zhan Y.All-trans retinoic acid enhances temozolomide-induced autophagy in human glioma cells U251 via targeting Keap1/Nrf2/ARE signaling pathway〔J〕.Oncol Lett,2017;14(3):2709-14.

14Muscarella LA,Barbano R,D′Angelo V,etal.Regulation of KEAP1 expression by promoter methylation in malignant gliomas and association with patient′s outcome〔J〕.Epigenetics,2011;6(3):317-25.