Wnt/β-catenin抑制剂DKK1调控类风湿关节炎的研究进展

兰维娅 唐 芳 马武开 姚血明 卢向阳 陈琳英 李 宇

(贵阳中医学院，贵州 贵阳 550002)

类风湿关节炎(RA)是一种自身免疫炎症性疾病〔1〕。Wnt通路通过调节细胞的各个功能，如生长、发育、增殖、分化和凋亡，同时参与调控成骨、软骨、滑膜和关节生理学等多方面的代谢调节。随着对Wnt信号通路的深入研究，发现此信号途径在RA患者成纤维样滑膜细胞(FLS)异常激活和增殖、成骨/破骨细胞平衡失调、软骨破坏和骨钙流失中发挥着及其重要的作用〔2〕。近年来，内源性Wnt通路的负调控蛋白如Dickkopf相关蛋白(DKK)1引起极大重视，这些负调控蛋白可作为调控Wnt信号通路的潜在治疗靶点。本文就Wnt/β-catenin/DKK1在RA发病机制中的调控作用进行深入探讨。

1 Wnt/β-catenin信号转导通路

Wnt信号通路根据是否有β-catenin参与分为经典通路和非经典通路，DKK1主要参与拮抗Wnt/β-catenin途径。当该途径被激活，分泌的Wnt蛋白与质膜上的卷曲蛋白(Fzd)在胞外区结合与低密度脂蛋白相关蛋白(LRP)5/6受体结合形成复合物，启动和激活Wnt经典信号通路。通过激活胞内的蓬乱蛋白(Dvl)，与轴蛋白(Axin)、Frat-1形成降解复合体，抑制糖原合成激酶(GSK)-3β活性，引起底物β-catenin去磷酸化，累积的游离β-catenin 在胞质中堆积，随后进入细胞核，β-catenin中一级结构的C末端取代转录抑制因子，继而与核内转录协同因子T细胞因子(TCF)/淋巴增强因子(LEF)-1结合形成三元复合物，通过刺激Wnt信号下游靶基因c-myc、细胞周期蛋白(cyclin)D1、骨形态发生蛋白(Bmp)2、基质金属蛋白酶(MMP)-3、MMP-13等的转录，促进成骨细胞的分裂、增殖和成熟，同时影响着破骨细胞的分化与成熟〔3～5〕。

2 DKK1蛋白结构及调控Wnt作用机制

2.1DKK1蛋白结构和生物学特征 DKK是Glinka等〔6〕在1998年研究两栖动物非洲蟾蜍胚胎细胞中发现的，在诱导胚胎头颈形成的过程中发挥着重要作用。DKK基因编码分泌型糖蛋白DKK1，基因全长1 815 kb，人类的DKK1结构及生物学功能基因定位于第10号染色体 10q11上，由266个氨基酸组成，包括由31个氨基酸组成的N端信号肽段、2个半胱氨酸富集区及具有糖基化作用的C端，相对分子质量为35。在脊椎动物中，DKK家族共有4种，DKK1、DKK2、DKK3和DKK4，它们具有高度同源性，其中DKK1和DKK4能抑制Wnt信号通路，但DKK4稍弱，DKK2既能活化Wnt信号通路也能起拮抗作用，而DKK3对Wnt信号通路没有明显的影响〔7〕。

2.2DKK1对Wnt调控机制 Wnt信号通路包括经典Wnt/β-catenin信号途径和非经典Wnt/JNK介导的Planer细胞极性途径、Wnt/Ca2+信号转导途径、Wnt/平面细胞极性(PCP)转导途径及Wnt/Rho途径。DKK1主要参与Wnt/β-catenin经典途径，拮抗其信号通路的传导。拮抗此信号通路机制主要以下两个方面：一方面DKK1能够在细胞外与Wnt蛋白辅助受体LRP5/6结合，此功能缺失突变表现为由骨形成降低所造成的骨量下降〔8〕；另一方面DKK1可通过与含有Kringle结构域的Kremen受体(包括Kremen-1和Kremen-2)结合，并与LRP5/6形成DKK1-LRP-Kremen三聚体，诱导细胞发生快速内吞，形成内吞小体，从细胞膜上除去LRP5/6，最终β-catenin被磷酸化而不能与核内LEF/TCF结合，从而抑制 Wnt经典信号传导通路〔9〕。

3 Wnt/DKK1对RA的调控

3.1Wnt信号通路调控骨代谢 当缺乏Wnt蛋白时，Wnt通路未被启动激活，上游基因β-catenin与结肠腺瘤息肉蛋白(APC)、Axin和GSK-3β结合形成复合体，有利于酪蛋白激酶1和GSK3促进β-catenin磷酸化,这时Wnt信号通路的作用被抑制，影响成骨细胞的分裂、分化和成熟，导致骨形成不足。激活Wnt信号通路可以促进造骨细胞的骨保护素(OPG)表达上调，后者能够抑制破骨细胞的分化而增加骨密度〔10〕。此外，Wnt信号通路组分基因被敲除(去卵巢小鼠)和通过构建转基因鼠模型也证实了Wnt/β-catenin通路影响的分化潜能间充质前体通过压抑过氧化物酶增殖物受体(PPAR)γ和增加关键成骨细胞转录因子的表达，引起成骨细胞的分化、复制或活动，影响骨基质的形成及钙化等，并可影响破骨细胞的发生和骨吸收，增加骨小梁的质量和强度〔11,12〕。

3.2Wnt/DKK1对RA成骨细胞的调控 成骨细胞中Wnt经典途径的血清DKK1抑制剂表达增强，通过结合LRP5/6 受体来抑制其转导，从而抑制成骨细胞活性，促进成骨细胞凋亡。Liu等〔11〕研究发现，成年RA患者，血清DKK1测定明显增高，尤其在RA活动期,且DKK1在RA不同阶段表达不同生理功能，据此猜测DKK1可能作为预测RA病情进展的新指标。Daoussis等〔12〕发现，DKK1在RA系统疾病中发挥了重要作用，通过激活Wnt信号，引起下游一系列基因转录，且把DKK1作为骨量增减的调节器，结果发现成骨细胞分化增加，同时间接影响破骨细胞的成熟，影响着骨代谢。上述这些研究说明，RA中骨重建和骨吸收的失衡可能是由于Wnt信号通路活动被DKK1结合LRP5/6 受体起拮抗作用而造成的。

Ke等〔13〕发现，RA动物模型中使DKK1分子表达减少可以提高成骨/破骨比例、促进骨重建。相反，Heiland等〔14〕则研究发现，一些炎症因子可以通过激活和增加DKK1进一步加速骨丢失、促进骨破坏。给RA模型小鼠注射抗-DKK1抗体，检测其成骨细胞因子，结果发现，OPG显著增加，骨重塑被激活，表明在小白鼠体内使用抗-DKK1药物发生了活跃的骨重建〔15〕。Manara 等〔16〕等应用肿瘤坏死因子(TNF)-α阻断剂抑制 DKK1发现，RA患者的骨破坏逐渐可逆转为骨重塑，改善患者关节功能，TNF-α作为DKK1的主要诱导剂，TNF-α阻断剂能有效的阻断DKK1的功能。可见，Wnt信号通路通过调控成骨细胞，增加骨形成，而其抑制剂DKK1表达增加，并与LRP5/6结合，降低β-catenin水平，使成骨细胞凋亡，减少骨形成和代谢。DKK1表达上调可能成为RA成骨细胞活性抑制的主要机制，而对于RA患者中成骨细胞的Wnt信号途径中的其他变化或是成骨细胞的其他信号通路影响还可以做更深入的研究。

3.3Wnt/DKK1对RA破骨细胞的调控 目前Wnt/β-catenin信号通路对破骨细胞的调控研究较少，其影响大多是作用于成骨细胞的基础上间接影响破骨细胞的功能。破骨细胞的Wnt/DKK1对RA的调控是通过影响RANKL-RANK-OPG 信号调节轴间接调控骨吸收发生的，其具体机制为：成骨细胞中Wnt信号途径的抑制因子DKK1上调，降低OPG /核因子-κB受体活化素配体(RANKL)比值，从而促进破骨细胞分化增殖，引发关节障碍。OPG是一种分泌型细胞因子，其蛋白序列类似于核因子-κB 受体活化素受体(RANK)，因此它可以通过竞争性结合RANKL，从而抑制破骨细胞的分化、成熟及破骨细胞的骨吸收作用，最终加速骨质破坏〔17〕。

在某种情况下，诱导Wnt信号通路的DKK1表达增强，减少成骨细胞特异性基因表达及OPG表达，间接增加破骨细胞生成，有利于其分化，从而造成非正常的骨质代谢；相反，DKK1阻断Wnt/β-catenin信号通路会诱导破细胞增殖、促进骨吸收。Wang等〔18〕通过去卵巢鼠实验发现，DKK1反义寡核苷酸处理组RANKL表达下降，抑制破骨细胞分化，进一步证实了DKK1通过抑制经典 Wnt/β-catenin 信号通路使破骨细胞基质形成和矿化减少，同时过表达DKK1的转基因小鼠骨形成和骨量明显减少。我们大胆猜想，通过应用DKK1的中和抗体治疗RA患者，可能起到阻断DKK1的作用，从而抑制Wnt/β-catenin 信号通路，延缓和阻止关节畸形。

4 小 结

综上所述，骨代谢过程中，成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收保持着动态平衡，而DKK1作为Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂，通过减少成骨细胞的数量，骨量减少，并且间接诱导破骨细胞分化，骨吸收加强。尽管DKK1抑制剂调控RA患者Wnt信号通路分子机制尚未阐明，但其阻止或延缓骨代谢疾病的发生及进程的积极作用是可以肯定的。由此得出，针对成骨、破骨细胞的Wnt/β-catenin信号途径抑制剂的抗DKK1抗体可能成为治疗RA的新靶点。

1Sandoval Garrido FA,Tamiya N,Kashiwagi M,etal.Relationship between structural characteristics and outcome quality indicators at health care facilities for the elderly requiring long-term care in Japan from a nationwide survey〔J〕.Geriatr Gerontol Int,2014;14(2):301-8.

2Weivoda MM,Ruan M,Hachfeld CM,etal.Wnt signaling inhibits osteoclast differentiation by activating canonical and noncanonical cAMP/PKA path ways〔J〕.J Bone Miner Res,2016;31(1):65-75.

3Saito-Diaz K,Chen TW,Wang X,etal.The way Wnt works:components and mechanism〔J〕.Growth Factors,2013;31(1):1-31.

4Li J,Zhou XD,Yang KH,etal.Hinokitiol reduces matrix metalloproteinase expression by inhibiting Wnt/β-catenin signaling in vitro and invivo〔J〕.Int Immunopharmacol,2014;23(1):85-91.

5Ueno K,Hirata H,Hinoda Y,etal.Frizzled homolog proteins,microRNAs and Wnt signaling in cancer〔J〕.Int J Cancer,2013;132(8):1731-40.

6Glinka A,Wu W,Delius H,etal.Dickkopf-1 is a member of a new family of secreted proteins and functions in head induction〔J〕.Nature,1998;391(6665):357-62.

7Niehrs C.Function and biological roles of the Dickkopf family of Wnt modulators〔J〕.Oncogene,2006;25(57):7469-81.

8Korvala J,Juppner H,Makitie O,etal.Mutations in LRP5 cause primary osteoporosis without features of OI by reducing Wnt signaling activity〔J〕.BMC Med Genetics,2012;13(1):26.

9Kristensen IB,Christensen JH,Lyng MB,etal.Expression of osteoblast and osteoclast regulator y genes in the bone marrow microenvironment in multiple myeloma:only up-regulation of Wnt inhibitors SFRP3 and DKK1 is associated with lytic bone disease〔J〕.Leuk Lymphoma,2014;55(4):911-9.

10Albers J,Keller J,Baranowsky A,etal.Canonical Wnt signaling inhibits osteoclastogenesis independent of osteoprotegerin〔J〕.J Cell Biol,2013;200(4):537-49．

11Liu YY,Long L,Wang SY,etal.Circulating Dickkopf-1 and osteoprotegerining rhrumatoid arthritis〔J〕.Chin Med J (Engl),2010;123(11):1407.

12Daoussis D,Andonopoulos AP.The emerging role of Dickkopf-1 in bone biology:is it the main switch controlling bone and joint remodeling〔J〕?Semin Arthritis Rheum,2011;41(2):170-7.

13Ke HZ,Richards WG,Li X,etal.Sclerostin and Dickkopf-1 as therapeutic targets in bone diseases〔J〕.Endocr Rev,2012;33(5):747-83.

14Heiland GR,Zwerina K,Baum W,etal.Neutralisation of Dkk-1 protects from systemic bone loss during inflammation and reduces sclerostin expression〔J〕.Ann Rheum Dis,2010;69(12):2152-9.

15Glantschnig H,Scott K,Hampton R,etal.A rate-limiting role for Dickkopf-1 in bone formation and the remediation of bone loss in mouse and primate models of postmenopausal osteoporosis by an experimental therapeutic antibody〔J〕.J Pharmacol Exp Ther,2011;338(2):568-78.

16Manara M,Sinigaglia L.Bone and TNF in rheumatoid arthritis:clinical implications〔J〕.Rmd Open,2015;1(Suppl 1):e000065.

17Boyle WJ,Simonet WS,Lacey DL.Osteoclast differentiation and activation〔J〕.Nature,2003;423(6937):337-42.

18Wang Y,Li YP,Paulson C,etal.Wnt and the Wnt signaling pathway in bone development and disease〔J〕.Front Biosci(Landmark Ed),2014;19(3):379-407．