非抗生素饲料添加剂在家禽弯曲杆菌控制中的应用

席　丽，秦新喜，李志强，韩进诚，张　辽，张春梅

（商丘师范学院生物与食品学院，河南商丘 476000）

弯曲杆菌病是目前世界上最常见的食源性人畜共患病之一。据报道，每年约有5亿例弯曲杆菌感染病例的发生（Kashoma，2015）。弯曲杆菌属目前有32个种13个亚种，其中最主要的是空肠弯曲杆菌（占感染的95%）和结肠弯曲杆菌（占感染的5%）（Hansson，2018）。弯曲杆菌普遍存在于家禽胴体、肠道及粪便中。消费者、活禽交易者和屠宰加工人员等可通过接触活禽、加工制品、食用未完全煮熟的禽肉或饮用被污染的水而感染弯曲杆菌。该菌进入动物胃肠道内可黏附于肠道黏膜上皮细胞上，引起毒素介导的炎症反应（Shank，2018）。长期处于抗生素压力环境中的弯曲杆菌产生了多重耐药性，表现为对环丙沙星、萘啶酮酸、四环素、红霉素、阿奇霉素、链霉素、庆大霉素、氯霉素及氨苄西林等两种或两种以上抗生素具备抵抗力（Cantero，2018；Gutiérrez，2017）。弯曲杆菌耐药性的产生和扩大不仅降低抗生素对家禽弯曲杆菌的有效控制率，还可能影响人类弯曲杆菌病的治疗效果，此外，抗生素的残留问题亦不容忽视。因此，家禽业正在寻求新的抗生素替代策略去降低活禽体内弯曲杆菌的携带率。本文对益生元、益生菌、噬菌体、有机酸及植物源性提取物等作为饲料添加剂对家禽控制弯曲杆菌的作用、机制及对家禽生产性能的影响做以阐述，以期为家禽生产中弯曲杆菌的控制提供理论基础。

1　益生菌

益生菌是一类活的微生物，通过多种途径可改善宿主的健康状况，包括：（1）保持胃肠道内常在菌与病原菌的平衡；（2）提高营养物质的消化率和吸收率；（3）发挥免疫调节和免疫刺激作用。Smialek等（2018）在探索益生菌混合物（乳酸乳球菌 1×109cfu/g、广布肉毒杆菌1×109cfu/g、干酪乳杆菌1×109cfu/g、植物乳杆菌1×109cfu/g和酿酒酵母1×107cfu/g）在抵抗肉鸡弯曲杆菌感染中的可行性时，将上述混合物以0.5 kg/t饲料的剂量添加于Ross 308肉鸡日粮中，研究结果表明，肉鸡饲料中添加该益生菌混合物可降低弯曲杆菌对肉鸡胃肠道的侵袭力，从而减少家禽饲养环境中的污染，最终改善肉鸡屠宰过程中的相关卫生指标。此外，该益生菌混合物还显示出良好的免疫调节作用，可提高肉鸡群整体防疫计划的有效性。Nothaft等（2017）研究表明，罗伊乳杆菌与大肠埃希菌（Escherichia coli，E. Coli）表达弯曲杆菌N-葡聚糖基因工程苗共用，可显著增强该疫苗的免疫效果。Saint Cyr等（2017）将唾液乳杆菌SMXD51添加于1日龄肉鸡日粮中，分别于14日龄和35日龄时测定盲肠弯曲杆菌的携带量，结果表明，该益生菌可显著减少14日龄和35日龄肉鸡盲肠内弯曲杆菌的携带量（14日龄 ：0.82 lg cfu/g；35日龄 ：2.81 lg cfu/g），同时可以使73%添加组的肉鸡弯曲杆菌携带量控制在7 lg cfu/g 以下。分类学分析显示，唾液乳杆菌SMXD51可诱导肉鸡肠道微生物菌系发生显著变化，还可部分限制弯曲杆菌对Anaerotruncus属细菌的抑制作用及Subdoligranulum属细菌的促进作用。肉鸡体内试验结果表明，该菌株具有一定的抗弯曲杆菌及改善胃肠道微生物菌系的能力。定期补充益生菌不仅可以降低家禽感染和患病风险，还可以降低家禽制品中病原菌如弯曲杆菌、沙门氏菌、李斯特菌等的污染，从而提高家禽类食品的安全性。

2　噬菌体

噬菌体是一类细菌病毒，可特异性感染并裂解靶细菌。近年来噬菌体作为一种新型生物控制措施应用于动物生产和食品加工过程中控制食源性病原菌的研究逐渐增多（Wernicki，2017）。根据噬菌体的形态、基因组大小和限制性核酸内切酶图谱可将弯曲杆菌裂解型噬菌体分为3类，即Group I～ Group III（Javed，2014）。其中 Group II成员对空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌均具有感染性，相比较之下，从家禽分离到的Group III成员对某些空肠弯曲杆菌菌株具有更强的裂解活性（Loc Carrillo，2005）。鉴于弯曲杆菌对噬菌体也可产生抗性这一现象，研究者试图通过使用2种及以上同组或不同组噬菌体来解决该问题。Hammerl等（2014）在比较多种Group II和Group III成员的宿主范围和裂解活性的基础上，比较两组噬菌体混悬物（CP14和CP81，各5.0×108PFU Vs. CP14和 CP68，5.0×108PFU和5.0×1010PFU）用于人工感染弯曲杆菌3871菌株的雄性Vrolix肉仔鸡的治疗效果。盲肠内弯曲杆菌计数结果显示，单独使用CP14可降低弯曲杆菌至少1 lg单位，CP14和CP81混合处理组对盲肠内弯曲杆菌无影响，而CP14和CP68混合处理组可降低弯曲杆菌至少3 lg单位。该结果说明，在使用多种噬菌体混合物时，需要根据其特性来筛选。抗性试验结果显示，肉鸡盲肠内分离到的弯曲杆菌对Group II成员CP68抗性最低（1%～ 2%），对来源于 Group III的 CP14和CP81产生的抗性可分别达到5%和4%。值得注意的是，弯曲杆菌对CP14和CP81混合处理组的抗性显著增高（7%～8%），这可能是导致该处理组盲肠内弯曲杆菌数未受控制的原因。Furuta等（2017）从购买的商品禽肉样品中分离到噬菌体，通过与当地家禽肝脏、肉、肠道及皮肤上分离到的弯曲杆菌共培养，获得当地优势弯曲杆菌特异性噬菌体混合物，应用于肉鸡饲养中同样可极显著减少弯曲杆菌的数量。如上所述，应用多种噬菌体除了可以降低弯曲杆菌产生抗性的机率，还可能更好地抵抗生产中空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌的众多菌株，从而起到更好的防治效果。在使用噬菌体混合物时，需要对混合物中所有噬菌体的抗性进行详细研究，并最好选择来源于不同组别的噬菌体，以拓宽其宿主范围、裂解能力，同时降低细菌对噬菌体的抗性产生能力。

3　益生元

益生元是一类可发酵的食物成分，可以选择性的刺激远端肠道有益菌的增殖。研究表明，益生元可利用多种机制，如产生短链脂肪酸、调节pH、与病原菌竞争结合位点等来改善宿主的健康状况。如双歧杆菌和乳酸菌可发酵低聚果糖（fructooligosaccharides，FOS）和低聚半乳糖（galactooligosaccharides，GOS）产生短链脂肪酸抑制病原菌的定植和生长（Guyard，2016）。Park等（2017）比较抗生素BMD50与益生元Biolex®MB40（酿 酒 酵 母 细 胞 壁 中 提 取 的 1，3-1，6-β-D-葡聚糖和甘露寡糖混合物）在肉仔鸡生长性能和盲肠微生物群的影响时发现，42日龄肉鸡益生元添加组白肉产出量极显著高于空白对照组和抗生素添加组，28日龄肉鸡盲肠弯曲杆菌数量显著低于空白对照组及抗生素添加组。另外，抗生素添加组极显著降低14日龄肉鸡肠道乳酸菌的数量。肉鸡生长性能的保持和白肉产量的提高、肠道弯曲杆菌数量的减少表明益生元Biolex®MB40可能替代抗生素成为家禽促生长剂的一种。Baffoni等（2017）验证一种微胶囊化的合生元制剂（长双歧杆菌PCB133和低聚木糖）对肉仔鸡空肠弯曲杆菌的控制效果，盲肠内微生物学分析结果显示，长双歧杆菌PCB133可以成功定植于盲肠内，同时盲肠内微生物群生理特性发生改变，空肠弯曲杆菌的数量显著减少。上述结果显示，该合生元制剂在养殖环节可有效降低肉鸡空肠弯曲杆菌的携带量，从而提高禽肉制品的生物安全性。

4　有机酸

有机酸或中链脂肪酸（medium chain fatty acids，MCFA）因其抗菌活性成为常用饮用水或饲料添加剂。Guyard等（2017）比较多种饲料添加剂对肉鸡弯曲杆菌携带量的影响发现，阳离子交换黏土型饲料添加剂与有机酸混合物（甲酸、甲酸钠、乳酸、丙酸）共同添加于71～78日龄散养肉鸡日粮及饮用水中，可显著降低鸡群弯曲杆菌携带量（与空白组相比，降低（0.82±0.25）lg cfu/g），而且还可显著降低屠宰时颈部皮肤弯曲杆菌的携带量（与空白组相比，降低（0.68±0.25）lg cfu/g），从而减少弯曲杆菌的传播及人类弯曲杆菌病的发病率。Gracia等（2016）将脂肪酸单甘油酯及中链脂肪酸混合饲喂1日龄Ross 308，与对照组相比，可显著降低盲肠弯曲杆菌的数量并可保持该作用到42日龄，因此，推测该混合物可作为一种较为长效的抑制剂应用于肉鸡弯曲杆菌的控制中。Thibodeau等（2015）研究肉仔鸡盲肠内弯曲杆菌的定植及一种混合酸酚饲料添加剂（主要成分山梨酸和百里香酚）对盲肠菌群的影响，结果表明，空肠弯曲杆菌在盲肠内的定植对盲肠菌群β多样性有影响；混合酸酚添加于日粮中可减少肉鸡空肠弯曲杆菌0.7 lg cfu，同时对盲肠菌群α和β多样性无影响，提示该添加剂可以在不干扰盲肠菌群的平衡下有效降低弯曲杆菌在盲肠内的定植。β-二羟基苯甲酸是一种植物酚类化合物，广泛分布于被子植物中，用于保护植物免受病原微生物侵害。该物质已被证实可有效减少食源性病原菌，如沙门氏菌、单核增生性李斯特菌、大肠杆菌等。Wagle等（2017）将β-二羟基苯甲酸（β- resorcylic acid，BR，0.5%）饲喂 1日龄肉仔鸡14 d，并于7日龄人工感染空肠弯曲杆菌4个菌株的混合物（106cfu/mL；250 mL/只），于第14天检测盲肠内容物弯曲杆菌数量，结果显示，BR添加组可显著降低盲肠内弯曲杆菌数（2.5 lg cfu），同时不影响肉鸡采食量和体增重。通过研究BR对弯曲杆菌定植能力（运动性、上皮细胞黏附性等）的影响发现，BR通过下调空肠弯曲杆菌编码运动能力基因（motA，motB，fliA）和黏附能力基因（jlpA，ciaB）从而显著降低弯曲杆菌的运动性和对Caco-2细胞的黏附及侵袭能力。这些结果表明，BR可以作为一种有潜力的饲料添加剂用于减少弯曲杆菌在肉鸡肠道中的定植。

5　植物源性饲料添加剂

植物源性生物活性物质根据其来源、配方、化学特性及纯度可分为以下4类：（1）草本（来自非木本、非多年生的开花植物）；（2）植物制剂（整个或部分植株，如，根、叶、树皮等）；（3）精油（芳香植物的挥发性成分经蒸馏、压榨、萃取等方法获得的油状物质）；（4）油树脂（植物辛香料经非水溶性溶剂浓缩萃取物）。某些植物及其特定成分提取物被研究证实具有一定的抗菌活性，因此，众多植物源性物质被开发用于改善动物生产性能及产品品质。与合成的抗生素和无机化合物相比，植物源性产品具有天然、毒性小、一般无残留等优点，被认为是一种较为理想的家禽有机生产过程中使用的饲料添加剂。已有研究表明，植物源性饲料添加剂可改善肉鸡生长性能，同时可降低病原菌的携带量。如辣椒素可减少盲肠内肠炎沙门氏菌、产气荚膜梭菌和大肠杆菌的携带量；巨朱蕉提取的油树脂可增加回肠和盲肠乳酸菌的数量，同时减少产气荚膜梭菌的量；肉桂醛可增加肠道双歧杆菌和乳酸菌的数量；麝香草酚可降低盲肠内容物中弯曲杆菌的数量（Diaz，2015）。月桂酸（十二烷酸），属于中链脂肪酸，主要来源于椰子油、油粽籽油、巴巴苏籽油及月桂油中。体外研究显示，弯曲杆菌对月桂酸的抗菌活性敏感。Zeiger等（2017）利用体内研究方法检测月桂酸添加在饲料中对Ross 308肉鸡肌肉组织中脂肪酸构成及性状和对结肠弯曲杆菌的影响。检测结果显示，肉鸡胸浅肌乳酸含量极显著升高；人工感染肉鸡胸浅肌结肠弯曲杆菌（5.9 lg cfu/g），共孵育6 d（4℃）后，月桂酸添加组肉鸡胸浅肌结肠弯曲杆菌携带量较对照组显著减少（添加组：3.5 lg cfu/g Vs. 对照组 ：4.3 lg cfu/g），显示肌肉中高水平月桂酸的抗菌活性。上述研究结果表明，月桂酸作为饲料添加剂应用于肉鸡饲养中可通过降低鸡肉中结肠弯曲杆菌的携带量从而提高食品安全。香芹酚通过作用于细菌细胞膜和细胞质的多个靶位点，可引起细菌细胞形态及功能的改变。Kelly等（2017）体外研究表明，香芹酚可减少弯曲杆菌对雏鸡肠道上皮细胞的粘附和侵袭能力，并可抑制弯曲杆菌生物膜的形成。将香芹酚添加于肉鸡日粮中，通过改善肠道菌群（乳酸菌、大肠杆菌等）的构成延迟肉鸡弯曲杆菌的感染日龄（添加组35 d Vs. 空白对照组21 d），从而显示出较好的抗生素替代物的潜能。

6　其他

弯曲杆菌的感染主要依赖于由极性鞭毛A介导的运动性、主要外膜蛋白的促生物膜生成能力及黏附作用（Mahdavi，2014）。因此，某些研究者正在尝试通过抑制弯曲杆菌生物膜的形成来控制家禽弯曲杆菌的携带率。Khattak等（2018）研究铁酪氨酸螯合物添加于日粮中对肉鸡空肠弯曲杆菌的影响（试验期：1～42日龄）发现，该添加剂可极显著抑制空肠弯曲杆菌生物膜的形成，减少弯曲杆菌在盲肠内的定植，增加盲肠内挥发性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA）的含量。盲肠内VFA含量增加，指示盲肠内厌氧细菌的发酵功能增加，研究证实与肉鸡肠道内肠杆菌科数量呈负相关。生物炭、膨润土和沸石作为饲料添加剂具有良好的安全性和有益作用，同时其可选择性地抑制病原菌的生长繁殖特性也受到人们的广泛关注。Prasai等（2016）将上述3种饲料添加剂分别按4%的添加量添加于蛋鸡日粮中，肠道菌群检测结果显示，生物炭、膨润土和沸石添加剂对蛋鸡肠道菌群的丰度和多样性均无显著影响，但某些种属的细菌和某些潜在病原菌的数目有所减少。可操作分类单位（operational taxonomic units，OTUs）检测结果显示，膨润土添加组蛋鸡肠道内未检测到已知弯曲杆菌属成员，同时胃肠炎螺杆菌、鸭源鸡杆菌、dorei拟杆菌和aldenense梭菌OTU未检测到，提示上述病原微生物被膨润土选择性抑制。生物炭和沸石具有相似但较温和的抑菌效果，其中生物炭可显著减少变形菌门细菌的数量。

7　结论

综上所述，上述非抗生素饲料添加剂可通过多种途径，如抑制弯曲杆菌生物膜的形成、降低其粘附黏膜或上皮细胞的能力、提高机体免疫功能、改善肠道吸收功能及增加内源性物质的抑菌作用等减少家禽弯曲杆菌的携带率，从而降低空肠弯曲杆菌经生物或非生物途径的传播。此外，抑制生物膜生成还可能提高抗生素对抗弯曲杆菌感染的治疗作用，最终降低人类弯曲杆菌病的发生率。但在商业推广之前还需要对上述添加剂的生产标准、添加剂量、保护机制及经济成本等问题做以详细研究。除此之外，加强家禽生产中生物安全措施、饮水安全、抗生素正规治疗、疫苗接种、遗传育种能综合措施的执行更有利于家禽弯曲杆菌的预防和控制。