饲料中动物源性成分检测技术的研究进展

戴海洁，唐　煜，梁　斌，张　憬，吴志奇，南玉琴，祝秀梅

（甘肃省兽药饲料监督所，甘肃兰州 730030）

动物源性饲料是以动物或者动物的副产物为原料，经加工制作而成的饲料，它含有丰富的脂肪、维生素、氨基酸以及矿物质，在饲料生产中广泛应用。但是，动物源性饲料容易受到微生物的污染，且易携带传染病原体，对畜产品的安全影响甚大。1986年，在英国的牛肉骨粉中首次检测到牛海绵状脑病（疯牛病）病原体（Rogberg等，2013）。为此，许多国家为确保生物安全，禁止在反刍动物饲料中添加肉骨粉，禁止动物源性成分的种内循环。随着经济技术的高速发展，越来越多的人关注产品质量安全，动物源性饲料的安全不仅关系到动物安全，同时关系到人类的正常生活。农业部在《饲料及饲料添加剂管理条例》中明确规定，禁止在反刍动物饲料中添加乳和乳制品以外的动物源性饲料产品。但由于动物源性饲料的营养成分含量较高，在生产养殖中广泛应用，而动物源性成分的检测需要较长的时间并有一定的环境要求，现场检测及管控有一定的困难度。因此，寻找和研究准确、快速、灵敏的检测方法刻不容缓，本文对动物源性成分的传统检测技术以及新型检测技术的优缺点进行综述。

饲料中动物源性成分的检测方法主要有理化技术、基于蛋白质的鉴别技术、基于DNA序列的分子生物学技术以及近年来所研究的新型技术。

1　动物源性成分的主要检测方法

1.1理化技术

1.1.1显微镜检法显微镜检法是欧盟（EU）认可的唯一检测动物源性成分的官方方法（Liu等，2011）。该方法主要是利用显微镜对各类组织的形态结构特征和细胞特征进行观察及判断，用来鉴别物种源性，可以用于动物饲料以及肉类掺假鉴别，例如肉组织切片（孙秀兰等，2012）。显微镜检法经常用于检测反刍动物饲料中哺乳动物蛋白，但其缺点是不能单独用来区分动物源性种类，且需要检测人员有丰富的经验及较高的显微镜操作水平。

1.1.2近红外光谱法近红外光谱（NIRS）分析技术是以量子力学为基础，利用分子振动测量其对光的吸收情况，用所得到的红外图谱来表示被测物质的特征。近年来，NIRS已应用在物质分析、食品检测及肉类掺假鉴别等多个领域。Murray等（2001）首次采用NIRS区分出含有肉骨粉的鱼粉，标明NIRS可以检测出2中不同动物的动物蛋白。NIRS其优点是检测快速、所需样品量少；其缺点是为非直接检测，需要对大量标准样品进行成分与组分分析建立数据库。

1.1.3显微近红外光谱分析技术（NIRM）显微近红外光谱（NIRM）分析技术是近红外光谱技术与光学显微镜检测技术结合的产物。吕程序等（2001）利用12个动物源性成分饲料样品建立偏最小二乘法（PLS）定标模型，采用NIRM对饲料中动物源性成分进行检测。Delgado等（2007）利用NIRM对动物饲料中肉骨粉进行了定性研究，结果表明NIRM可对动物饲料中的肉骨粉含量进行检测。该方法可以检测饲料中的所有颗粒，但缺点是不能进行种类特异性鉴别。

1.1.4色谱鉴别法色谱鉴别法是通过液相、气相等色谱进行源性分析。Schonherr等（2002）分别利用动物种间特异性的短肽类物质的分布情况建立用于定性鉴别肉类成分的高效液相色谱技术。该方法比较敏感，可区分源性种类特异性，但样品制备比较繁琐，操作相对复杂。

高效变性液相色谱技术（DHPLC）是一项在单链构象多态性（SSCP）和变性梯度凝胶电泳（DGGE）基础上发展起来的新的杂合双链突变检测技术。DHPLC实现了高通量自动化检测，具有较高的灵敏度和特异性，且检测DNA片段和长度变动范围广，能够纯化DNA片断，但只能检测杂合突变。我国学者采用DHPLC对动物成分特异性PCR扩增产物进行分析。王金玲等（2010）应用PCR反应结合变性高效液相色谱（DHPLC）技术建立饲料中鸡源性成分的快速检测方法，结果表明，PCR-DHPLC检测灵敏度在DNA水平上达到了2.04 ng/μL。王秋艳等（2010）建立了关于食品及动物饲料中牛源性成分PCR-DHPLC，得到牛源性成分PCR-DHPLC特征峰型图，样本检测的峰型图可用于定性或定量监测样本中牛源性成分的动态变化。

1.2基于蛋白质的鉴别技术

1.2.1十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。SDS-PAGE法是将蛋白质用十二烷基硫酸钠（SDS）变性和溶解，再进行凝胶电泳。该方法是根据蛋白质亚基分子量的不同来进行区分蛋白质，一般采用的是不连续缓冲系统，有较高的分辨率，但现一般用于肉品种属鉴定（李冰玲等，2008）。

1.2.2酶联免疫吸附反应（ELISA）法ELISA又称酶标法，是酶的高效催化作用和抗原抗体免疫反应的特异性有机结合。根据试剂来源、样品情况以及检测条件，ELISA技术主要有直接法、间接法、双抗体夹心法、直接竞争法、间接竞争法、捕获包被法、斑点免疫吸附法和组织印迹法等多种类型（Arif等，2009）。ELISA法的优点是测定速度快、操作简单，缺点是有一定的局限性（例如：与植物蛋白存在交叉反应以及具有热敏性，易导致出现假阳性结果），因此ELISA法可作为初步筛选方法。

1.3基于DNA序列的分子生物学技术

1.3.1DNA 杂交技术DNA杂交技术是基于DNA序列特征识别动物源性的鉴别技术，是应用核酸分子的变性及复性的性质，依据碱性互补的关系使得DNA片段形成的杂交双链分子。石丰运等（2010）利用 DNA 分子杂交原理建立了能同时检测牛、山羊、猪、鸡4种动物成分的基因芯片法，实现了对多种动物源性成分的种类检测。DNA杂交技术灵敏性较高，但操作复杂且不能自动化。

1.3.2PCR技术聚合酶链式反应（PCR）是利用DNA聚合酶和引物对DNA模板进行复制扩增。

1.3.2.1传统PCR法传统的PCR法主要采用凝胶电泳分离以及荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物。传统的PCR法一般分为内参照法、竞争法、PCR-ELISA法。使用内标法也可对传统PCR法进行定量检测，但由于待测样本的起始拷贝数未知，所以无法加入适量的已知模板作为内标，故而只能算作半定量的。刘烜等（2009）同时对含有牛、羊、猪等 6 种动物源性成分饲料中的 DNA提取产物进行六重扩增，对紫外透射光下凝胶成像系统的电泳结果进行特异性鉴定，证明多重PCR方法具有较高的特异性和灵敏度。传统PCR法的优点是具有很高的灵敏度，但存在定量效果差，电泳污染等问题，并有大量繁琐的后续工作。

1.3.2.2实时荧光定量PCR法实时荧光定量PCR（PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。根据荧光物质的不同可分为Taqman荧光探针法和SYBR GreenⅠ荧光染料法。探针法可通过探针增加反应收集信号的特异性，能够用于多重体系反应，可预测和提前进行反应条件的优化；染料法经济实惠，可做溶解曲线，但特异性不高。赵冉等（2012）使用Taq Man探针对线粒体 DNA（mt DNA）进行提取扩增，建立了定性三重荧光 PCR检测方法，且该方法检出限可达10-5。PCR法采用阳性对照、阴性对照以及空白对照，可对环境进行实时监测，并具有简便、灵敏、准确等优点，有效地提高了饲料检测的工作效率。

1.3.3环介导等温扩增技术（LAMP）法环介导等温扩增技术（LAMP）是一种新颖的恒温核酸扩增方法，利用一种链置换DNA聚合酶，在等温条件（63℃左右）保温30～60 min，即可完成核酸扩增反应。LAMP 是一种全新的核酸扩增方法，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。徐淑菲等（2016）以环介导等温扩增（LAMP）荧光检测方法为基础，建立并优化了牛源性成分 LAMP 检测方法，该方法操作简单、特异性强，有较强的灵敏度、反应时间短等优点，且检测成本远低于荧光定量PCR。

1.3.4限制性片段长度多态性（RFLP）限制性片段长度多态性（RFLP）是发展最早的DNA标记技术。RFLP是指基因之间因限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的的差异。CAPs技术又称为限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）技术，是利用引物进行扩增，对相应PCR扩增片段使用内切酶进行酶切处理，以检测其多态性。由于使用限制性内切酶导致酶切分析不便（李林等，2006），增加了研究成本，所以限制了该技术的广泛应用。

末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）分析是一种在通用引物的末端标记荧光，利用限制性酶切片段长度差异检测生物个体间差异的分子标记技术。该技术具有高效可重复性，可以对一个生物群体的特定基因进行定性和定量测定。汪琦等（2010）利用12S rRANA 基因的限制性酶切末端片段长度多态性建立一种精确可靠的鉴定常见动物种类的方法，实验得到的末端片段长度与理论值非常接近。T-RFLP法操作简单、结果精确，适用于鉴定动物种类。T-RFLP法具有较高的分辨率、结果准确可靠，并能简化结果分析，但对实验室的仪器要求比较高（孙婕等，2014）。

1.4新型技术

1.4.1可视化环状等温扩增技术（vLAMP）可视化环状等温扩增技术（vLAMP）是一种现场可视化的筛查方法。朱珠等（2014）采用钙黄绿素染料，应用vLAMP技术对牛、羊源性成分进行快速扩增并完成现场可视化检测，同时建立牛、羊源成分人工污染的饲料模型，对灵敏度进行考察，灵敏度高达 0.001%。vLAMP技术的特异性与灵敏度比较高，且具有操作简单快速等优点，可用于现场源性成分检测。

1.4.2微滴式数字PCR方法微滴式数字PCR方法是在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理，经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行检测，对微滴的荧光信号进行判别阴阳性，根据泊松分布原理得出起始浓度。王珊等（2015）首次建立一种定量检测羊肉制品中羊源和猪源性成分的微滴式数字PCR方法。任君安（2017）采用微滴式数字PCR技术，建立了针对羊肉及其多种动物源性掺假成分的定性及精准定量检测方法。微滴式数字PCR方法实现了精准定量，计算直接准确且无需标准曲线（Hindson等，2013）。

2　小结

动物源性成分的检测不仅用于兽医学的研究，还可以控制人畜共患病及动物传染疾病的传播，因此，必须加强动物源性饲料的质量安全监督管理。目前用于动物源性成分的检测方法有很多，继续研究和开发多种简单、快捷、高效、经济的源性成分检测技术或手段，是促进我国动物源性饲料安全的一项重要技术举措。此外，现有的动物源性检测技术对所添加的物质不能区分，未来动物源性检测技术将致力于提高灵敏度和特异性，应进一步开发现场检测技术以及相应的检测试剂盒，对动物源性成分饲料做到随时随地监管和评估。