淫羊藿苷对高糖培养条件下大鼠骨髓基质细胞Shh通路的影响

李春梅 王 馨 吴丽春 康立勋 李海清 马晟利

(黑龙江省医院口腔科，黑龙江 哈尔滨 150001)

2型糖尿病(T2DM)占糖尿病患病人群的93.7%〔1〕。糖尿病是代谢性疾病，由于长期胰岛素分泌缺陷或者胰岛素功能缺陷导致以高血糖为特征的一种系统性疾病〔2〕。淫羊藿苷是一种传统的补益中药，其性味辛、甘、温，体现出强筋骨、补肾阳、祛风湿等各方面的作用。在临床上被广泛用于骨折、骨代谢相关的多种疾病的治疗中，已取得了显著疗效〔3〕。Shh信号通路可以调控一些成骨相关因子的表达，如骨形成蛋白(BMP)22、BMP27、骨桥蛋白(OPN)、骨钙素(OCN)等〔4〕，因此在调控软骨形成、骨形成、骨骼发育、异位成骨发挥重要作用。有学者〔5〕将外源性Shh基因转入实验性糖尿病大鼠体内，发现Shh基因对大鼠的微血管重塑、创口愈合等方面都有一个明显的促进，说明Shh信号通路激活可以改善糖尿病大鼠的软组织愈合。 Shh是一种典型的分泌蛋白，在体内有较高的表达。合成后将会自我水解并形成C-片段和N-片段。其中N-片段的C-末端受到外部环境刺激而和胆固醇相结合，共同构成活性空间结构。一般情况下，只有在Shh存在的状态下，补丁基因(PTCH)才能够顺利的和光滑基因(SMO)结合，从而产生对传导通路的抑制作用。Shh影响之下，两者相结合，从而客观上消除了PTCH对SMO的抑制作用。Shh信号通路是一个多功能的信号通路，不但可以调控软骨形成、骨形成、骨骼发育、异位成骨等，还可以促进糖尿病大鼠的软组织愈合，使得血管重塑，创口愈合时间降低。本探讨淫羊藿苷在高糖培养环境下，对大鼠骨髓基质细胞Shh信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1动物、试剂及仪器 取100 g左右雄性SD大鼠3只，颈椎脱臼处死。传三代培养，获得骨髓基质细胞〔4〕。Super M-MLV 反转录酶、高纯总RNA快速提取试剂盒RNase固相清除剂、Powder琼脂糖、50×TAE2×Power Taq PCR MasterMix(武汉博士德生物工程有限公司)。超速冷冻离心机(湖南湘仪)，微量移液器(BIOHIT)，真空干燥箱(SYSBERY)，紫外分光光度计(Thermo)，荧光定量PCR仪(BIONEER)。

1.2实验方法 实验分为：正常组(2%胎牛血清+DMEM培养的细胞)，高糖组(2%胎牛血清+高糖-DMEM培养的细胞)，淫羊藿苷组1(2%胎牛血清+DMEM+淫羊藿苷培养的细胞)，淫羊藿苷组2(2%胎牛血清+高糖-DMEM+淫羊藿苷培养的细胞)。取各组细胞提取总RNA,反转录得到cDNA。利用韩国BIONEER公司生产的ExicyclerTM 96荧光定量仪进行荧光定量分析。按照实验方法中的步骤进行RNA提取，并利用紫外分光光度计对提取的RNA浓度进行测定。本实验每种样本每个基因进行4个复孔平行实验，实验数据的选取，是舍去误差较大的数值，取剩余数值的平均值作为最终实验保留数据。利用2-△△CT方法分析数据，以正常组为1。

1.3统计学方法 采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

淫羊藿苷组1 PTCH1(1.82±0.03)和SMO(1.50±0.07)基因表达明显高于其他组，淫羊藿苷组2 PTCH1(1.44±0.02)和SMO(1.20±0.05)基因表达分别明显高于高糖组(0.74±0.04，0.71±0.05)和正常组(1.00±0.03，1.00±0.02)，说明淫羊藿苷增强高糖环境下骨髓基质细胞的Shh信号通路表达能力。

3 讨 论

糖尿病可引发骨代谢异常，进而导致多种糖尿病骨病(比如，骨量下降、骨折率上升等)。口腔骨丢失会对患者产生两种重要影响，其一为牙齿存留，其二为义齿修复〔6〕。此外，糖尿病可引发牙槽骨丧失，还会导致黏膜损伤，所以患者往往都对修复治疗无法忍受。当糖尿病患者人数逐渐上升，而相关医疗水平也日益提升时，糖尿病治疗亦日趋复杂化。糖尿病与牙周病之间存在一种双向调节关系。当人发生急性感染后，其内分泌状态及其代谢状态都会发生变化，因此血糖控制很差，所以牙周感染会对糖尿病患者造成影响，使其无法很好地控制血糖。有鉴于此，糖尿病治疗应注重牙周病的防治，否则可增加治疗难度。但在现实生活中，口腔医生对于糖尿病所引发的口腔并发症往往是较为忽视的。此外，对于糖尿病患者而言，维护口腔健康是一件十分重要的事情，假如牙科医生不能充分重视这一点，那么口腔健康也无法得到保障〔7〕。不过，对糖尿病患者口腔疾病的诊疗维护需要有足够的糖尿病知识作后盾，而口腔科医生在这方面最为欠缺，这些都是亟待解决的。淫羊藿苷是中医治疗骨质疏松最常用的药物之一。作为淫羊藿的精华部分，淫羊藿苷在近年来被广泛应用于成骨、破骨细胞的干预研究中〔8〕。本研究结果说明高糖可以抑制Shh信号通路的激活，而高糖同时可以抑制骨髓基质细胞的成骨，淫羊藿苷则能增强高糖环境下Shh信号通路的激活。

4 参考文献

1靳思思，胡洁芬，吴 文.Shh在雷奈酸锶促进骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用〔J〕.中国病理生理杂志，2014；12(1)：159-64.

2李 丽，蒙秋蓉，郭 琦，等.Shh信号参与调控BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化〔J〕.中国生物工程杂志，2014；9(1)：9-15.

3李 丽，董 谦，冯巧灵，等.Shh促进BMP9诱导的小鼠间充质干细胞C3H10T1/2的成骨分化〔J〕.基础医学与临床，2014；12(21)：1629-34.

4李 丽，欧欣颖，吉彩霞，等.激活Shh信号通路促进BMP9诱导小鼠成肌细胞C2C12向成骨分化〔J〕.中国生物化学与分子生物学报，2015；5(6)：481-8.

5陈美玲，宋 珂，黄梦琪，等.Shh修饰骨髓间充质干细胞与不同骨移植材料复合的体外观察〔J〕.临床口腔医学杂志，2011；3(10)：138-40.

6宋 珂，饶念静，陈美玲，等.bFGF及Shh时序传递促进骨再生的实验研究〔J〕.中国口腔种植学杂志，2011；16(1)：11-2.

7陈群力，周淑琴，须 冰，等.高效液相色谱法同时测定大黄灵脾颗粒中丹酚酸B和淫羊藿苷的含量〔J〕.安徽医药，2016；21(1)：46-9.

8张 攀，史 娟，刘 力，等.淫羊藿苷及其衍生物的抗氧化活性研究〔J〕.中国食品添加剂，2016；14402(5)：85-8.