实验设计在ADC药物处方筛选中的应用

杜翊+章燕珍+谭小钉

摘 要 目的：运用实验设计（DOE）方法优化抗体偶联药物（ADC）处方筛选，以得到适用于该ADC药物的较优处方。方法：利用JMP 10软件进行DOE，考察蛋白浓度、pH、蔗糖和吐温20浓度等因素对ADC药物稳定性的影响。结果：经过DOE方法的优化，得到了蛋白浓度（10 mg/ml）、pH （5.0）、蔗糖浓度[6%（w/v）]和吐温20浓度[0.02%（w/v）]的优选组合。结论：DOE方法能优化处方，提高ADC药物的稳定性，为其他ADC药物的处方筛选提供了借鉴。

关键词 实验设计 ADC药物 处方筛选

中图分类号：R927.11； R979.19 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2018）01-0071-05

Application of design of experiment in the formulation screening of antibody drug conjugate

DU Yi， ZHANG Yanzhen， TAN Xiaoding*

（Central Research Institute， Shanghai Pharmaceuticals Holding Co.， Ltd.， Shanghai 200237， China）

ABSTRACT Objective： To optimize the formulation screening of antibody drug conjugate （ADC） by a method of design of experiment （DOE） so as to obtain a superior formulation for the ADC drug. Methods： DOE was performed by a software JMP 10 to investigate the effects of the concentrations of protein， sucrose and polysorbate 20 and pH value on the stability of ADC drug. Results： A preferred combination including 10 mg/ml protein， 6% （w/v） sucrose and 0.02% （w/v） polysorbate 20 and pH 5.0 was obtained by optimization of DOE method. Conclusion： DOE can optimize the formulation and improve the stability of ADC drug. This study can also provide a reference for the screening of other ADC drugs.

KEY WORDS design of experiment； ADC drugs； formulation screening

在過去的几十年中，抗肿瘤药物研发取得巨大进展，尤其是生物制品的出现，使临床可选的抗肿瘤药物品种显著增加。传统小分子化疗药物具有非特异性，容易引起严重的不良反应；具有靶向性的单克隆抗体选择性较强，不良反应较轻，但是由于单克隆抗体靶向治疗的有效率并不高，且存在耐药与疗效问题，因此，抗体-药物偶联物（antibody-drug conjugate，ADC）作为一种新型药物结合了抗体的靶向性和小分子药物的细胞毒作用[1-2]。ADC药物进入体内后，通过单抗的导向作用与靶细胞表面的抗原结合，进入靶细胞内，然后通过化学或酶促作用释放小分子药物而杀灭靶细胞[3]。

ADC药物制剂处方开发的目标是确保为患者提供质量稳定可靠的产品。与传统单抗药物相比，在安全、质量和疗效等方面，ADC药物具有其独特的物理化学性质。其质量属性通常可以分为三类：与抗体本身相关、与小分子药物相关及与抗体-小分子偶联形式相关。如抗体本身相关的聚体，可影响药物的免疫原性[4]及药代动力学特性；游离小分子会影响药物的安全性；抗体药物偶联比可影响药物安全性和药代动力学特性[5]。这些关键属性都可能因处方的不同而改变，因此，筛选出好的处方对于ADC药物保持良好的稳定性和安全性具有重要意义。

实验设计（DOE）是以数理统计和概率论为基础、合理安排实验的方法论，研究如何制定实验方案，以提高效率，缩小误差，高效且经济地获取数据，并进行分析处理，最后得出正确的结论。传统的多数设计是先追求目标值，通过筛选不同因素来减少波动，结果只能得到单因素的最优化，但是由于参数搭配不佳而整体性能不稳定。田口方法则是先追求产品的稳定性，通过分析质量特性与不同元素之间的非线性关系（交互作用），找出稳定性的最佳水平组合[6-7]。随着DOE的广泛使用，越来越多的DOE软件得到开发和应用，如SPSS、Minitab、JMP等。其中，JMP是赛仕软件公司（Statistical Analysis System）推出的一种交互式可视化统计分析软件，其实验设计内容丰富，实验设置灵活，分析功能强大，可大大提高实验效率[8-10]。因此，本研究应用JMP 10.0软件进行田口实验设计，对得到的数据进行分析，预测实验结果并找出最佳参数。

1 材料与方法

1.1 ADC药物

本研究中的ADC药物为注射用重组抗HER2人源化单克隆抗体-MCC-DM1偶联剂，是一种由氨基酸序列和曲妥珠单抗（赫赛汀，herceptin）相同的抗体与细胞毒类药物美登素衍生物（DM1）通过不可裂解的硫醚连接桥偶联而成的制剂，连接分子（linker）为SMCC。由上海医药集团股份有限公司中央研究院生物药物室制备。endprint

1.2 主要仪器和试剂

BSA822电子天平（赛多利斯公司）；Akta avant蛋白纯化系统（GE）；1260高效液相色谱仪（安捷伦公司）；SpectraMax M5多功能酶标仪及SoftMax分析软件（美国Molecular Devices）；PA 800 plus毛细管电泳仪（贝克曼公司）；紫外分光光度计（Thermo Fisher Scientific）。琥珀酸、吐温20（J. T. Baker）；蔗糖、氢氧化钠（湖南尔康制药股份有限公司）；超纯水（自制）。

1.3 处方DOE设计

根据单因素实验结果选取蛋白浓度、pH、蔗糖浓度及吐温20浓度用于DOE试验。利用JMP 10.0进行DOE设计，其中蛋白浓度选取3水平、pH为2水平、蔗糖浓度为3水平、吐温20浓度为3水平，共设计18个试验组（表1）。

1.4 缓冲液置换及稳定性考察

称取适量的蔗糖、琥珀酸和吐温20溶解于超纯水中，用3 mol/L氢氧化钠调节溶液pH，配制成表1中的不同蔗糖浓度、不同pH和不同吐温20浓度的处方缓冲溶液。

使用Akta avant蛋白纯化系统连接分子筛将适量的ADC药物样品置换至上述配制好的处方溶液中。置换好后的溶液无菌过滤并分装至6 ml的灭菌西林瓶中，压塞，

加铝塑盖，在25 ℃条件下进行加速稳定性实验，考察时间为3个月。

2 质量指标

方法均为企业自行开发并验证。

2.1 尺寸排阻色谱法（SEC）纯度分析

色谱柱：TSKgel G3000SWXL（7.8 mm×300 mm，5 mm）；流动相：（20 mmol/L 磷酸二氢钾+0.25 mol/L氯化钾，pH=6.95±0.05）-异丙醇=85∶15；流速：0.5 ml/min；上样量：100 mg；柱温：室温；样品池温度：8 ℃；检测波长：280 nm。用Agilent 1260高效液相分析系統对实验结果进行数据处理，用面积归一化法计算纯度。

2.2 CE-SDS纯度分析

将样品用纯水稀释至5.0 mg/ml，将20 ml 样品、75 ml SDS-MW样品缓冲液、2 ml内标和 5 ml 0.25 mol/L碘乙酰胺（非还原CE-SDS）混匀后，65 ℃孵育4 min，冷却至室温，取100 ml，采用Beckman PA800 plus毛细管电泳系统上样分析， 于15 kV分离，毛细管温度及样品传送带温度均为20 ℃，检测波长为220 nm。

2.3 游离小分子分析

色谱柱：Agilent ZORBAX 300SB-C18（4.6 mm×100 mm，3.5 mm）；流动相：0.02% TFA水溶液（流动相A），0.02% TFA乙腈溶液（流动相B）；流速：1.0 ml/min；上样量：20 ml；柱温：30 ℃；检测波长：252 nm。用Agilent 1260高效液相分析系统对实验结果进行数据处理，用面积归一化法计算游离小分子的量。

2.4 体外生物学活性分析

0.25% Trypsin-EDTA消化BT-474细胞，用 DMEM/ F12完全培养基将细胞重悬，调整活细胞密度至1.5×105 cells/ml，100 ml/孔加入96孔板，37 ℃，5% CO2恒温培养箱中培养2～4 h。用DMEM/F12完全培养基将抗体稀释至5 mg/ml，再用稀释液2倍系列稀释（共9个梯度），50 μl/孔加入96孔细胞培养板，以DMEM/F12完全培养基作为阴性对照，以参比品作为阳性对照。37 ℃，5% CO2恒温培养箱中培养5 d，加入CCK-8染色液，每孔25 ml。5% CO2、37 ℃恒温培养箱培养4～6 h。以450 nm读取酶标仪上吸光度值。结果计算：利用SoftMax软件分析数据，以抗体浓度对数为横坐标，对应吸光度值为纵坐标，选用四参数方程回归模型，拟合抗体剂量效应曲线。按下式计算生物学活性：

3 结果

3.1 处方筛选SEC、CE-SDS、游离小分子及体外生物学活性结果

本研究中采用SEC聚体、CE-SDS小分子片段、游离小分子含量及体外生物学活性进行后续的分析，结果如图1所示。

25 ℃加速条件放置下，SEC聚体、CE-SDS小分子片段和游离小分子3个月与0个月的差值越小表示处方前后变化越小，越稳定。图1初步显示：可以看出高浓度蛋白的处方SEC聚体变化明显高于低浓度蛋白的处方。低、中浓度蛋白组的体外生物学活性整体高于高浓度蛋白组。

3.2 处方DOE数据分析

选择SEC聚体、CE-SDS小分子片段、游离小分子25 ℃加速3个月与0个月时的变化值和3个月时各处方的体外生物学活性为响应值，应用JMP 10.0软件对田口正交表L18（21×33）中的处方进行预测刻画，刻画结果如图2所示，各处方的刻画意愿如表2所示。

图2显示pH较低时，处方的意愿增高；蛋白浓度10 mg/ml和20 mg/ml对于整体意愿的影响比30 mg/ml小；10 mg/ml时的最佳处方意愿值0.76，20 mg/ml时的最佳处方意愿值为0.71，30 mg/ml时最佳处方意愿值仅0.51。因此为了保证ADC药物的稳定，处方蛋白浓度应该低于30 mg/ml。表2显示处方B和处方H的意愿值分别为0.76和0.71，二者的意愿值相差不大，为了后续工艺的可行性及临床使用的方便性和安全性，最终选择蛋白浓度为20 mg/ml，即最后选择的 ADC药物的较优处方为处方H，即pH 5.0、蛋白浓度 20 mg/ml、蔗糖含量6%（w/v）及吐温20含量0.02%（w/v），并对该处方的一批成品进行长期稳定性考察。endprint

3.3 长期稳定性考察结果

对上述处方下的一批成品进行长期稳定性考察。长期稳定性试验温度定为2～8 ℃，考察12个月。分别在试验期第0、3、6、9、12个月末取样分析SEC纯度、游离小分子药物、DAR和生物活性等相关指标，结果如图3所示。

图3表明成品在2～8 ℃条件下放置12个月期间，SEC纯度、CE-SDS纯度、生物学活性、游离小分子和DAR均无明显变化。说明在优化处方（处方H）下，样品在2～8 ℃条件放置12个月后质量稳定性良好。

4 讨论

本研究通过对蛋白浓度、pH、蔗糖浓度和吐温20浓度的优化，筛选出优化处方H，即20 mg/ml ADC药物、6%（w/v）蔗糖、0.02%（w/v）吐温20和pH 5.0。在该处方下，样品在25℃加速3个月后，聚体、小分子片段及游离小分子的变化较小，体外生物学活性较高，经JMP 10.0預测刻画后，意愿值较高。经长期稳定性考察，ADC药物的各项理化性质保持良好的稳定性，表明该处方适合此ADC药物。

抗体偶联药物的处方研发与传统药物类似，尽管如此，当将小分子与偶联药物的质量属性一起考虑时，制剂处方开发将变得更加复杂，需要考虑的因素更多。聚体是由天然或变性单体组成的高分子量蛋白质，是导致免疫原性的重要因素之一[11-13]；聚体和小分子片段为样品中的大小变异体，影响样品整体的纯度；样品中游离小分子的含量则影响安全性，若样品中存在较高的游离小分子药物，将对正常细胞造成严重损伤[14-15]。生物学活性测定是生物测定的重要内容，因此，本研究采用SEC聚体、CE-SDS小分子片段、游离小分子和体外生物学活性作为刻画的关键质量属性，得到了使ADC药物稳定的优化处方。表明这四个关键质量属性适合用于ADC药物处方筛选的DOE刻画。此DOE方法达到了预期的优化效果，且具有较好的稳定性。本研究将田口正交法用于ADC药物处方筛选设计中，通过较少的实验次数，获取优化后的设计参数，提高设计效率，降低了设计成本，为其他ADC药物的处方筛选提供了借鉴。

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