Menin和CyclinD1在非特殊型浸润性乳腺癌中的表达及意义

龚静青+曹端荣+邹桂华+李晓鸣+柳玉红+邱立

【摘要】 目的：探讨非特殊型浸润性乳腺癌组织中Menin蛋白和细胞周期素D1（CyclinD1）表达的相关性，以及两者与乳腺癌淋巴结转移生物学行为和临床分期的关系，进而探讨Menin蛋白和CyclinD1在乳腺癌的发生及转移过程中的作用。方法：采用免疫组织化学SP法检测71例伴有或不伴有淋巴结转移的乳腺癌组织中Menin蛋白和CyclinD1的表达情况，然后研究其相关性。结果：Menin蛋白和CyclinD1在本研究乳腺癌癌组织中的表达阳性率分别为19.72%（14/71）和77.46%（55/71），两者表达存在负相关（r=-0.411，P<0.05）。Menin蛋白和CyclinD1表达与乳腺癌的TNM分期有关（P<0.05），但与乳腺癌患者的年龄和肿块大小无明显关系（P>0.05）。Menin蛋白和CyclinD1在存在淋巴结转移组的乳腺癌癌组织中，前者有淋巴结转移组阳性率低于无淋巴结转移组（P<0.05），而后者有淋巴结转移组阳性率高于无淋巴结转移组（P<0.05）。结论：Menin蛋白和CyclinD1参与了乳腺癌的发生和发展，Menin蛋白的失活可能在乳腺癌发生及转移过程中起重要作用，而CyclinD1基因的过度表达也与乳腺癌的发生及转移有关。

【关键词】 非特殊型浸润性乳腺癌； Menin； 细胞周期素D1； 淋巴结转移

【Abstract】 Objective：To explore the non-special invasive breast carcinoma tissues Menin protein and CyclinD1 expression of correlation，and the clinical stage and lymph node metastasis of breast cancer biology behavior and the relationship， then dicusses the role of Menin protein and CyclinD1 in the occurrence and metastasis of breast cancer.Method：The expression of Menin protein and CyclinD1 were detected by SP immunohistochemical method in 71 cases with or without lymph node metastasis in breast cancer，and studied their correlation.Result：Menin protein and CyclinD1 in the study of breast cancer in the positive expression rate of 19.72%（14/71） and 77.46%（55/71），the expression had a significant negative correlation（r=-0.411，P<0.05）.The expression of Menin protein and CyclinD1 was associated with the TNM staging of breast cancer（P<0.05），but has no obvious relation of the patients age and tumor size（P>0.05）.Menin protein and CyclinD1 in breast cancer lymph node metastasis group，the lymph node metastasis group was lower than that without lymph node metastasis（P<0.05），while the positive rate of the group with lymph node metastasis than those without lymph node metastasis（P<0.05）.Conclusion：The expressions of Menin and CyclinD1 are closely related to lymphatic metastasis of non-special invasive breast carcinoma，the inactivation of Menin protein would be play an important role in the development of breast cancer，over-expression of CyclinD1 is related to the occurrence of breast cancer.

【Key words】 Non-special invasive breast carcinoma； Menin； CyclinD1； Lymphatic metastasis

First-authors address：The Peoples Hospital of Baoan District in Shenzhen City，Shenzhen 518101，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.33.008

非特殊型浸潤性乳腺癌（non-special invasive breast carcinoma）是来自乳腺上皮的恶性肿瘤。在中国，乳腺癌的发病率和死亡率在逐年增加，是女性最常见的恶性肿瘤之一。乳腺癌的发生、发展过程有诸多因素参与，除与生育史、内外源性激素肥胖、运动等因素外，还与多种原癌基因过度表达和部分抑癌基因的失活有关，相关的有细胞周期素（Cyclin）、C-erbB2、Bcl-2、P53、Rb等。Menin蛋白为抑癌基因Men1所编码的保守蛋白，研究显示Menin蛋白在转录调节、基因组稳定、细胞分裂增殖及细胞周期调控中扮演重要角色，且参与细胞分裂增殖及与调控细胞周期的蛋白相互作用[1-2]。细胞周期蛋白D1（CyclinD1）是一种原癌基因，在细胞周期中起正调控作用，前者在肿瘤的发生发展过程中扮演重要角色[3-4]。文献[5]研究表明，Menin蛋白可通过与NF-κB相互作用来抑制NF-κB介导的CyclinD1的转录从而达到对细胞增殖的抑制。本研究主要探讨乳腺癌中CyclinD1蛋白与Menin蛋白两者表达的相关性及其意义，现报告如下。endprint

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2013年1月-2015年12月深圳市宝安区人民医院的原发性乳腺癌手术标本71例，手术患者均为女性，年龄33～75岁，中位49岁。纳入标准：（1）非特殊型浸润性乳腺癌病理诊断标准按2012年WHO肿瘤分类标准；（2）病理诊断均由相同两位高级病理医师证实为非特殊型浸润性乳腺癌；（3）所有患者术前均未接受放、化疗；（4）按国际抗癌联盟UICC分期标准行TNM分期；（5）所有病例临床资料完整，其中28例患者伴有腋窝淋巴结转移。排除标准：乳腺癌复发病例。

1.2 方法 所有试剂均购自广州安必平医药科技有限公司，应用免疫组化SP法檢测71例乳腺癌标本中CyclinD1和Menin蛋白的表达，用已知阳性片作为阳性对照。将乳腺癌标本进行脱水、石蜡包埋、4 μm切片和烤片（60 ℃，2 h），二甲苯脱蜡、梯度酒精处理，3%H2O2 37 ℃孵育10 min，磷酸盐缓冲液（PBS）反复冲洗3次，5 min，血清工作液封闭，滴加相应一抗，37 ℃孵育2 h，PBS冲洗，（同时使用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照），滴加生物素二抗，之后滴加辣根过氧化物酶标记二抗，37 ℃孵育30 mim，PBS冲洗，DAB显色，用自来水冲洗，苏木素染色，脱水，透明，封片，使用显微镜观察。

1.3 结果判读 根据文献[6]报道，Menin和CyclinD1核染色百分比及强度积分相加方法判断阳性及阴性，方法如下，免疫组化阳性百分比0分：无肿瘤细胞阳性；1分：比例为1%～25%；2分：比例为26%～50%；3分：比例为51%～75%；4分：比例为76%～100%。免疫组化着色强度0分：细胞未染色为；1分：淡黄色；2分：棕黄色；3分：棕褐色。百分比及着色强度得分相加：0～3分判定为阴性，4～7分判定为阳性。

1.4 统计学处理 本实验使用SPSS 16.0统计学软件对所有数据进行解析，计数资料采用率（%）表示，比较采用 字2检验，相关性分析采用Spearman法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Menin蛋白和CyclinD1在两组乳腺癌组织中的表达 71例乳腺癌组织中Menin蛋白和CyclinD1均主要在癌细胞的细胞核中表达，两者的阳性率分别为19.72%（14/71）和77.46%（55/71），见图1、2。

2.2 Menin蛋白和CyclinD1表达与乳腺癌淋巴结转移之间的关系 在伴有淋巴结转移组的乳腺癌组织中，Menin蛋白的表达比无淋巴结转移组低，差异有统计学意义（P<0.05）。在伴有淋巴结转移组的乳腺癌组织中CyclinD1表达的阳性率明显高于无淋巴结转移组，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.3 Menin蛋白和CyclinD1表达与非特殊型浸润性乳腺癌临床病理特征的关系在乳腺癌TNM分期中，分期越晚，Menin蛋白表达的阳性率越低，差异有统计学意义（ 字2=7.265，P<0.05）；而CyclinD1表达情况正好相反，即临床分期越晚CyclinD1表达的阳性率越高，差异有统计学意义（ 字2=6.754，P<0.05）。而Menin蛋白和CyclinD1的表达与乳腺癌肿瘤的其他临床病理特征如肿瘤大小和患者年龄均无明显关系（P>0.05），见表2。

2.4 Menin蛋白和CyclinD1在乳腺浸润癌导管癌组织中表达的相关性 71例乳腺癌组织中，Menin蛋白和CyclinD1表达均阳性6例；Menin蛋白表达阳性而CyclinD1阴性8例；Menin蛋白表达阴性而CyclinD1表达阳性49例；Menin蛋白及CyclinD1均阴性8例。Menin蛋白和CyclinD1表达呈负相关（r=-0.411，P<0.05），见表3。

3 讨论

文献[7]研究表明，我国乳腺癌发病逐年上升，每年新发病例数约24.9万，城市发病人数高于农村，且发病中位年龄越来越年轻，乳腺癌居女性癌症发病首位。在我国乳腺彩超是筛查乳腺癌常用检查，但我国人口基数大，发病人数之多，乳腺癌虽然其生存率大幅提高，但加强乳腺癌预防、研究其发病机制及提高预后还是一项艰巨任务。

乳腺癌发病的危险因素众多，究其基因水平的病因，基因的异常表达也与乳腺癌的发生、发展密切相关，原癌基因的激活和抑癌基因的失活在整个乳腺癌发生和发展过程中扮演重要角色[8-9]。

本实验旨在研究CyclinD1在非特殊型乳腺癌中的表达情况及其与淋巴结转移生物学行为和临床分期的关系。在本实验71例乳腺癌病例癌组织中CyclinD1阳性率为77.46%，且随临床分期的增高，CyclinD1的阳性率在不同分期中具有升高趋势，差异有统计学意义（P<0.05）；这与张荣君等[10]的结论相一致，他们认为CyclinD1表达的阳性率在乳腺癌的TNM不同分期中比较，差异有统计学意义（P<0.05）。本实验中乳腺癌伴淋巴结转移组CyclinD1阳性表达率显著高于无淋巴结转移组（P<0.05），提示CyclinD1在乳腺癌淋巴结转移中起着重要促进作用，故检测癌组织中CyclinD1的表达情况对判断乳腺癌是否有淋巴结转移倾向具有重要参考价值，这与文献[11]研究相符。CyclinD1基因所编码的CyclinD1蛋白直接参与细胞周期调控，是G1期细胞增殖的关键蛋白，其通过结合并激活G1时期特有的周期蛋白依赖性激酶CDK4使Rb蛋白磷酸化，从而调控细胞周期G1-S的过渡，它的异常表达可以与多种肿瘤的发生发展有关，如基底细胞癌、膀胱癌及骨肿瘤等[12]。此外，文献[13]研究表明，在乳腺癌病例中，CyclinD1蛋白在乳腺癌病理组织分型中，级别越高，表达越高；且低表达组比高表达组的患者生存率要高，无淋巴结转移的患者比有淋巴结转移的患者生存率高。本实验中，乳腺癌临床分期越高且伴有淋巴结转移比无淋巴结转移组的CyclinD1阳性率高。这些均提示CyclinD1蛋白在乳腺癌中可能通过促进细胞周期G1-S的过渡，从而促进乳腺癌发生发展，所以检测乳腺癌组织中CyclinD1蛋白表达及有无淋巴结转移对有无患者生存率有着重要的意义。endprint

本研究涉及的Menin蛋白是由Men1所编码，后者是一种抑癌基因，它的异常是导致Wermer综合征的关键因素之一。Men1定位于染色体11q13，其编码Menin蛋白。它主要分布在细胞核中，Menin蛋白分子量为67Da，由610个氨基酸构成，属于保守蛋白的一种。Men1基因突变导致的Menin蛋白表达异常或核转位异常将引起一系列信号通路紊乱，从而导致肿瘤或疾病的发生发展。国内外研究关于Menin蛋白肿瘤抑制功能的研究也越来越多。

目前多关注Menin蛋白与多种内分泌肿瘤的发生发展有密切关系，如：甲状旁腺、肾上腺、垂体等。但Menin蛋白在多种不同肿瘤中通过不同途径起作用，例如它通过与组蛋白调节酶和转录因子相互作用，从而抑制胰腺癌细胞在体内外生长[14]，在胃癌AGS细胞株中，Menin高表达可能通过抑制P13K/Akt和NF-ΚB信号转导通路从而降低其生长，起到抑制胃癌的作用[15]，Menin可抑制人类肾癌细胞的增殖[16]。研究表明Menin蛋白在乳腺癌的相关文献中作用不尽相同，例如，Menin蛋白定位于乳腺癌细胞的细胞核，且它与雌激素受体（ER）相互作用，从而增强乳腺癌细胞中雌激素的活性，并且他们在临床研究还证实，在使用雌激素受体调节剂雷洛昔芬的乳腺癌的患者中，Menin蛋白阳性的乳腺癌比阴性的治疗效果差[17]。乳腺癌作为一种受激素影响的肿瘤，Hitomi等[18]在乳腺癌细胞的研究中表明，Menin蛋白可通过激活ERα的AF-2的联合区域，从而调节ERα转录功能，以影响乳腺癌的发生发展。目前关于Menin在非特殊型浸润性乳腺癌组织中表达情况及临床病理特征的相关性少见报道，本实验旨在探讨Menin蛋白在非特殊型乳腺癌中的作用及其淋巴结转移生物学行为和临床分期的关系，以及Menin在乳腺癌中的可能存在的作用及其与CyclinD1在乳腺癌中的作用。

本实验证实，在71例非特殊型浸潤性乳腺癌中，通过免疫组织化学方法，Menin蛋白定均位于细胞核中，而苏宝威[19]在乳腺癌MCF-7细胞株中通过免疫荧光定位方法发现，Menin主要定位于细胞核中，但在细胞质及细胞膜中均有不同程度的表达，他认为在细胞质及细胞膜中表达可能因为Menin有许多核定位信号（NLSs），提示其转录活性可能与其进出细胞核能力有关。Menin在细胞核中通过与其他关键转录因子相互作用，从而起到基因表达调控作用[20]，本实验表明乳腺癌组织切片中通过免疫组化结果Menin定位于细胞核此外Imachi等[17]在乳腺癌MCF-7细胞株中发现Menin定位于细胞核中，这与本实验研究一致，这些提示在乳腺癌组织切片中Menin蛋白定位细胞核是否与乳腺癌MCF-7细胞株中定位相一致，且目前关于细胞质和细胞膜中Menin蛋白的作用目前尚不明确，这些均提示需对相关Menin蛋白进一步研究。

本实验表明，71例乳腺癌中Menin蛋白表达阳性（14/71）明显少于阴性例数（57/71），Menin蛋白表达与乳腺癌TNM分期有关系，即临床分期越晚Menin蛋白表达的阳性率越低，这表明Menin蛋白的失活，使其抑制肿瘤细胞的增殖的作用降低，而临床分期越晚Menin蛋白表达的阳性率越低起一定作用。非特殊型浸润性乳腺癌伴淋巴结转移组Menin阳性表达率显著低于无淋巴结转移组（P=0.006）。本研究提示，Menin蛋白在乳腺癌中发生发展过程中起抑制作用。

肿瘤危险因素众多，其中基因异常是常见因素，它的发生又是多个基因表达相互协同、共同作用的结果。通过分子机制研究发现，NF-κB、Smad-3、bJunD等是调节细胞增殖的关键的转录因子，Menin蛋白与它们相互作用，从而起到抑制细胞增生的作用，Men1与Menin蛋白通借助抑制细胞增殖，从而发挥降低肿瘤发病概率的目的，阻止肿瘤细胞增殖有多种机制，而其中一种机制为：Menin蛋白通过与NF-κB相互作用来抑制NF-κB介导的CyclinD1的转录从而导致细胞增殖的抑制[5]。这让笔者假设，在乳腺癌发病中，Menin蛋白能否通过NF-κB通路，从而影响CyclinD1的转录，从而抑制肿瘤的发生发展。本实验结果显示：乳腺癌中Menin蛋白表达与CyclinD1表达呈负相关（r=-0.411，P<0.05），提示Men1基因的失活导致Menin蛋白表达的减少及CyclinD1基因的表达与乳腺癌发生发展密切相关。

本实验中Menin蛋白和CyclinD1在不同年龄组及不同肿块大小组中的阳性率比较，差异均无统计学意义（P>0.05），说明Menin蛋白和CyclinD1与乳腺癌患者的年龄和肿瘤大小可能无关。综合CyclinD1和Menin蛋白在有无淋巴结转移中的表达情况及临床分期的结果提示，在乳腺癌的发生发展中可能是通过Menin蛋白的失活，从而解除了对NF-κB介导的CyclinD1的转录的抑制，导致CyclinD1基因的过度表达，CyclinD1为G1期细胞增殖的关键蛋白，它的表达异常可能导致细胞的异常增殖而导致乳腺癌的发生和发展。目前已知的乳腺癌相关的基因有40多个，其中最常见的是BRCA1和BRCA2，但乳腺癌的发生是多种异常基因共同的结果，且是多步骤的过程，而这一过程是否有其它因子的参与，确切机制如何，尚需相关实验进一步证实。

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（收稿日期：2017-10-16） （本文编辑：张爽）endprint