γ—干扰素释放试验、荧光定量PCR、结核菌素皮肤试验联合检测对涂阴性肺结核的诊断价值

李强饶+常红+黄渤

【摘要】 目的：研究γ-干扰素释放试驗（IGRA）、荧光定量PCR（FQ-PCR）、结核菌素皮肤试验（TST）三种方法联合检测对涂阴性肺结核的诊断价值。方法：选取确诊的33例涂阴性肺结核和30例非结核的肺部感染患者，分别使用酶联免疫法（ELISA法），测定患者全血干扰素的浓度，荧光定量PCR法检测患者肺泡灌洗液的结核杆菌DNA，卡介菌纯蛋白衍生物（BCG-PPD）进行结核菌素皮肤试验。结果：γ-干扰素释放试验、荧光定量PCR、结核菌素皮肤试验三种检测方法在肺结核组和非肺结核组的阳性率比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；三种检测方法在肺结核组的阳性率比较，差异有统计学意义（P<0.05）。γ-干扰素释放试验方法的灵敏度为84.85%，特异度为86.67%，Youden指数为0.72；荧光定量PCR方法的灵敏度为60.61%，特异度为83.33%，Youden指数为0.44；结核菌素皮肤试验的灵敏度为81.82%，特异度为53.33%，Youden指数为0.35。联合检测试验中以IGRA平行联合FQ-PCR（Youden指数为0.66）和IGRA系列联合TST（Youden指数为0.63）的诊断效能最好。结论：γ-干扰素释放试验较荧光定量PCR、结核菌素皮肤试验对涂阴性肺结核有更好的诊断价值，联合检测试验以IGRA平行联合FQ-PCR诊断价值最佳。

【关键词】 干扰素释放试验； 荧光定量PCR； 结核菌素试验； 涂阴性肺结核； 诊断价值

【Abstract】 Objective：To study the diagnostic value of the combination of interferon gamma release assay （IGRA），fluorescence quantitative PCR （FQ-PCR） and tuberculin skin test （TST） for the diagnosis of smear negative pulmonary tuberculosis.Method：Thirty-three patients diagnosed smear negative pulmonary tuberculosis and 30 cases of no tuberculosis were detected by using three ways，the IGRA was completed by detecting the patient of concentration of blood interferon with using ELISA；mycobacterium tuberculosis DNA was measured in bronchoalveolar lavage fluid by using fluorescent quantitative PCR；the tuberculin skin test was achieved by using Purified Protein Derivative of BCG （BCG-PPD）.Result：The IGRA，FQ-PCR，TST were significant differences in positive rate of pulmonary tuberculosis group and non tuberculosis group（P<0.05）；and the positive rate of the three detection methods were significant differences in pulmonary tuberculosis group too（P<0.05）.The sensitivity of interferon gamma release assay was 84.85%，the specificity was 86.67%，the Youden index was 0.72；the sensitivity of fluorescence quantitative PCR was 60.61%，the specificity was 83.33%，the Youden index was 0.44；the sensitivity of TST was 81.82%，the specificity was 53.33%，the Youden index was 0.35.The diagnostic efficacy of the IGRA parallel connected FQ-PCR test（its Youden index was 0.66）and the IGRA series connected TST test（its Youden index was 0.63）was better in all connection test.Conclusion：The diagnostic value of interferon gamma release assay is best in the three detection for smear negative pulmonary tuberculosis，and the diagnostic value of IGRA combined in parallel with FQ-PCR is best in all combined detection.

【Key words】 Interferon release assay； Fluorescence quantitative PCR； Tuberculin skin test； Smear negative pulmonary tuberculosis； Diagnostic valueendprint

First-authors address：The Affiliated Hospital of Jiujiang College，Jiujiang 332000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.33.002

我国是全球22个结核病高负担国家之一，结核病发病人数居全球第二位，防治任务艰巨。对于涂阳性肺结核的患者，很容易被诊断并能给予及时抗结核治疗，但是临床上往往存在大量涂阴性肺结核的患者，因无法及时诊断，导致患者病情延误，造成不良后果[1-3]。过去使用结核菌素皮肤试验是临床辅助诊断肺结核的常用方法，但是它的假阳性率较高，导致过度治疗[4-7]。近几年，文献[8-11]报道，γ-干扰素释放试验对诊断肺结核有较高的敏感性和特异性，但是其鉴别肺结核潜伏性感染和活动性感染有一定困难。本研究开展了γ-干扰素释放试验联合肺泡灌洗液荧光定量PCR、结核菌素皮肤试验三种检测手段来评估对涂阴性肺结核的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 研究对象为2015年1月-2016年9月因肺部感染在本院呼吸科住院患者。入选标准：（1）年龄18～75岁；（2）临床上有咳嗽、咳痰症状；（3）胸片或胸部CT提示肺部阴影，考虑肺部感染。排除标准：（1）妊娠妇女；（2）意识障碍、严重高血压、心律失常、重度心功能不全患者；（3）排除非感染性肺部疾病如肺水肿、肺部肿瘤、肺栓塞、非感染性肺间质性疾病、肺血管炎等。入选患者被分为两组，试验组即涂阴性肺结核组，诊断标准是按照中国结核病防治规划实施工作指南（2008年版）[12]，涂阴性肺结核诊断标准如下：（1）三次痰涂片阴性，胸部影像学检查显示与活动性肺结核相符的病变（与原发性肺结核、血行播散性肺结核、继发性肺结核、结核性胸膜炎任一种肺结核病变影像学表现相符）且伴有咳嗽、咳痰、咯血等肺结核可疑症状；（2）三次痰涂片阴性，胸部影像学检查显示与活动性肺结核相符的病变且抗结核抗体检查阳性；（3）三次痰涂片阴性，胸部影像学检查显示与活动性肺结核相符的病变且肺外组织病理检查证实为结核病变者；（4）三次痰涂片阴性的疑似肺结核病例经诊断性治疗或随访观察可排除其他肺部疾病者；（5）三次痰涂片阴性，纤维支气管镜灌洗液检出抗酸分枝杆菌；（6）三次痰涂片阴性，支气管或肺部组织病理证实结核病变；符合上述6条诊断标准中1条即可诊断。试验组所有病例均随访3个月，排除非结核性感染性肺病，最终获得确诊，共入选33例患者，其中男23例，女10例，平均年龄（45.0±3.2）岁。对照组为非结核肺部感染组包括社区获得性肺炎、肺癌伴阻塞性肺炎、支气管扩张伴感染、慢性阻塞性肺病伴感染，最终入选30例，

其中男20例，女10例，平均年龄（43.0±2.5）岁。两组患者的一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，所有入选患者均签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂 γ-干扰素释放试验仪器采用武汉海吉力生物科技有限公司生产的HGNElisa01型全自动酶联免疫工作仪，试剂为武汉海吉力生物科技有限公司研制的结核杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒，荧光定量PCR法仪器为采用美国Perkin Elmer公司5700全自动PCR分析仪器，试剂采用中山大学达安基因股份有限公司PCR检测试剂盒。结核菌素皮肤试验试剂采用卡介菌纯蛋白衍生物，为北京祥瑞生物制品有限公司生产，国药准字S10960019。

1.3 方法

1.3.1 γ-干扰素释放试验 采用酶联免疫吸附法检测血中γ-干扰素的浓度，具体操作步骤如下：使用BD肝素锂抗凝采血管抽取入组患者4～5 mL静脉血，轻柔颠倒混匀20次左右，使抗凝剂充分溶解送本院检验科；检验者3 h内将采集的全血分装到3种不同的培养管中，“T”管为添加了结核特异性抗原ESAT-6、CFP-10的测试培养管，“N”管为本底对照培养管，“P”管为添加了非特异刺激原植物凝血素（PHA）的阳性对照培养管，每种培养管分装1 mL血样，分装后轻柔颠倒培养管20次左右，并立刻置于37 ℃培养箱中，静置培养20～24 h后取出，离心收集上清液，然后用采用酶联免疫吸附法定量检测三种管中血上清液中γ-干扰素的浓度，最后根据各管检测的γ-干扰素的浓度来判定是否为结核杆菌感染阳性。具体结果判定的参考值如下：（1）N≤8 IU/mL，P-N任何值，T-N≥0.35 IU/mL并且≥N/4，判定为阳性；

（2）N≤8 IU/mL，P-N≥0.5 IU/mL，T-N<0.35 IU/mL

或≥0.35 IU/mL但

1.3.2 荧光定量PCR 入组患者均在本科室常规行电子支气管镜（型号为Pentax3500）检查，按常规电子支气管镜操作准备，检查前均禁食、禁饮4 h，并签署内窥镜检查同意书，检查前给予利多卡因局麻，根据患者胸部CT资料，在病变肺段行支气管肺泡灌洗术，收集肺泡灌洗液约30 mL，立即送本院PCR室，行熒光定量PCR检测结核杆菌DNA。检测采用结核分支杆菌核酸扩增荧光检测试剂盒（由中山大学达安基因股份有限公司生产），荧光定量PCR仪器为美国Perkin Elmer公司5700全自动PCR分析仪，操作步骤严格按试剂盒说明书进行，结果分为阳性和阴性。

1.3.3 结核菌素皮肤试验 入组患者均在本科住院部由护士行结核菌素皮肤试验，试验采用卡介菌纯蛋白衍生物试剂（北京祥瑞生物制品有限公司生产，国药准字S10960019），方法如下：使用5 IU结核菌素试剂在患者左前臂掌侧行皮内注射，记录时间，72 h后观察结果；判定标准为：（1）硬结直径（d）<5 mm为阴性（-）；（2）硬结直径≥5～10 mm为弱阳性（+）；（3）硬结直径≥10～20 mm为阳性（++）；（4）硬结直径≥20 mm或局部出现水泡、坏死或有淋巴炎，均为强阳性（+++）。阳性和强阳性判定为阳性。

1.4 统计学处理 统计学处理使用SPSS 18.0统计软件，三种检测方法阳性率结果比较，采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义；按诊断试验评价方法计算三种诊断试验的灵敏度、特异度、准确度、Youden指數、阳性预测值。

2 结果

2.1 两组三种检测方法的阳性率比较 肺结核组的γ-干扰素释放试验、荧光定量PCR、结核菌素试验的阳性率，与非肺结核组比较，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.2 三种检测方法在肺结核组的阳性率比较 三种检测方法在肺结核组的阳性率比较，差异有统计学意义（ 字2=6.27，P<0.05），见表2。

2.3 三种检测方法单独诊断肺结核的效能评价 三种检测方法单独诊断肺结核的效能评价，见表3。

2.4 三种检测方法联合检测的诊断效能评价 三种检测方法联合检测的诊断效能评价结果，见表4、5。

3 讨论

肺结核在我国发病率仍然居高不下，2010年全国肺结核发病率为78/100 000，据此估计全国肺结核患者仍有百万之多[13]。过去传统诊断肺结核是依靠痰涂片抗酸染色检测结核分枝杆菌，但是它的阳性率较低，仅有30%～40%，而且不能区别结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌；痰结核杆菌培养法是诊断肺结核的金标准，但长达4～6周的培养时间，严重影响临床及时诊断性。况且临床上常常遇到大量涂阴性肺结核，诊断往往较为棘手，曾经很长一段时间TST是诊断涂阴性肺结核感染的唯一手段，由于它价格低廉、操作方便，被各级医院广泛使用；但是由于我国广泛接种卡介苗，TST所用的试剂某些抗原成分与卡介苗及非结核分枝杆菌的某些抗原成分相同很容易造成假阳性，造成特异度降低，导致误诊。此外TST的细胞免疫反应需要正常免疫反应和时间，而老年人、免疫功能低下和免疫缺陷患者易造成假阴性，导致漏诊。因此临床急需要灵敏度和特异度均较高的诊断肺结核的方法。干扰素释放试验是近几年来发展起来的用于检测结核分枝杆菌感染的新方法，它是利用结核分枝杆菌特异性抗原即早期分泌靶抗原6（ESAT-6）和培养分泌蛋白10（CFP-10），在体外刺激受检者全血或外周血单个核细胞（PBMC），使T淋巴细胞产生大量γ干扰素（IFN-γ），然后用酶联免疫吸附法（ELISA）或酶联免疫斑点法（ELISPOT）检测IFN-γ浓度或计数分泌IFN-γ细胞的方法[14]。这两种抗原蛋白具有高度特异性，在卡介苗和大多数非结核分枝杆菌中均不存在，因此不会造成假阳性。国外文献[15]报道其检测潜伏性结核感染（LTBI）的敏感性达70%～80%，特异性达88%～97%，均高于TST，因此2005年美国FDA已批准IGRA作为诊断结核分枝杆菌感染的辅助诊断手段应用于临床。对于活动性肺结核诊断价值，文献[1-5]报道其敏感性为76%～90%，特异性为86%～96%，大大高于TST检查。本研究显示，IGRA在肺结核组和非结核肺部感染组的阳性率比较，差异有统计学意义（P<0.001），其单独诊断涂阴性肺结核的灵敏度为84.85%，特异度为86.67%，与文献[1-11]报道基本一致，本研究还显示IGRA的Youden指数高达0.72，Youden指数是综合了灵敏度和特异度的信息，大量研究表明诊断试验的Youden指数若大于0.7，则代表该诊断试验有较高的诊断价值，因此本文研究提示IGRA对涂阴性肺结核有较高的诊断价值，与文献[1-11]研究相符。

FQ-PCR法是目前较为成熟的检测技术，具有高灵敏性、高准确性、高特异性、定量范围宽、操作简便、快速安全，已运用临床十余年。过去由于其易污染、假阳性及不能定量，影响临床诊断效果，本研究使用荧光定量PCR技术集PCR和DNA探针杂交技术的优点为一体，直接探测PCR过程中的荧光变化，获DNA模板的准确定量结果。整个过程在闭管状态下进行，避免了因污染而导致的假阳性，因此结果较以往更加准确、可靠。此外本研究标本采用患者肺泡灌洗液，直接从患者肺部病变处获取标本，因此理论上应能够提高诊断阳性率，但本研究显示此项检测方法在肺结核组的阳性率为60.61%，与IGRA阳性率比较，差异有统计学意义（P<0.05），其灵敏度为60.61%，特异度为83.33%，Youden指数为0.44，诊断效能不尽如意，与文献[16-20]报道有所出入，原因考虑本研究肺泡灌洗液取的标本相对较少或行肺泡灌洗的肺段部位有时会出现一定误差，从而导致阳性率和灵敏度下降。TST是较为经典、成熟的检测肺结核的方法，正如上面所述，TST所用的试剂某些抗原成分与卡介苗及非结核分枝杆菌的某些抗原成分相同很容易造成假阳性，造成特异度降低，导致特异性较差，本研究显示TST的灵敏度为81.81%，特异度为53.33%，与文献[21]报道基本一致。

正如上述所说，IGRA在诊断肺结核有较高的敏感性和特异性，但是它无法鉴别结核潜伏性感染还是活动性感染，而FQ-PCR有较好的特异性，TST有较高的灵敏度，三种或两种方法联合检测是否能产生更高的诊断价值？本研究显示三种检测方法并联联合检测，Youden指数仅为0.37，而三种检测方法串联联合检测，Youden指数也只有0.41，均低于IGRA的单独检测的诊断效能。而两种方法联合检测试验中，以IGRA平行联合FQ-PCR和IGRA系列联合TST的的Youden指数较高，均接近达到0.7，好于三种方法联合检测的诊断效能。为何出现如此结果，首先考虑根据联合检测计算灵敏度和特异度的方法，当灵敏度明显升高时，反而导致特异度显著下降，而特异度显著提高时，灵敏度反而明显下降，最终导致综合灵敏度和特异度的Youden指数反而并没有显著增加；此外由于本研究时间不长，样本量偏小，也可能产生一定误差，因此有待今后加大样本量进一步研究。因此根据本研究的结果，三种检测方法联合检测，并不优于两种方法联合检测，从经济角度考虑，临床上对待诊断较困难的涂阴性肺结核，IGRA是较好的辅助诊断方法，必要时联合PQ-PCR或TST检测。endprint

参考文献

[1] Pai M，Zwerling A，Menzies D.Systematic review：T-cell-basedassays for the diagnosis of lalent tuberculosis infection：an update[J].Ann Intern Med，2008，149（3）：177-184.

[2] Ahmad S.New approaches in the diagnosis and treatment of latent tuberculosis infection[J].Respir Res，2010，11（3）：169.

[3] Diel R，Goletti D，Ferrara G，et al.Interferon-γ release assays for the diagnosis of latent Mycobacterium tuberculosisinfection：a systematic review and meta-analysis[J].Eur Respir J，2011，37（1）：88-89.

[4] Kim S Y，Jung G S，Kim S K，et al.Comparison of the tuberculin skin test and interferon-γ release assay for the diagnosis of latent tuberculosis infection before kidney transplantation[J].Infection，2013，41（1）：103-110.

[5] Diel R，Loddenkemper R，Nienhaus A.Evidence-based comparison of commercial interferon-gamma release assays for detecting active TB：a meta analysis[J].Chest，2010，137（4）：952-968.

[6]周祖模，金嘉琳，王森，等.全血γ干扰素释放试验在活动性肺结核诊断中的应用[J].中华实验和临床感染病杂志：电子版，2012，6（6）：527-531.

[7]楊新婷，贾红彦，李琦，等.全血γ干扰素释放试验在菌阴肺结核中诊断价值的临床观察[J].中国临床医生，2013，41（3）：42-45.

[8]宋其生，陈秀琴，赵琴.结核菌素纯蛋白衍生物试验净增值与γ-干扰素释放试验在结核病群体感染中的诊断价值[J].中华结核和呼吸杂志，2012，35（9）：669-672.

[9]李红，唐神洁，史祥等.全血γ-干扰素释放试验对涂阴肺结核诊断价值的研究[J].中华临床医师杂志：电子版，2012，6（16）：4894-4897.

[10]伍仕敏，项杰，周虹，等.γ-干扰素释放试验在肺结核和肺外结核诊断中的应用[J].武汉大学学报：医学版，2013，34（3）：403-406.

[11]章淑梦，周毕，符一骐，等.γ-干扰素释放试验在活动性肺结核病的临床价值[J].中华结核与呼吸杂志，2014，37（5）：372-373.

[12]卫生部疾控司.中国结核病防治规划实施工作指南[M].北京：中国协和医科大学出版社，2009：26-27.

[13]王辰，陈荣昌.呼吸病学[M].2版.北京：人民卫生出版社，2014：110-111.

[14]骆宝建，吕平欣.γ-干扰素释放试验在结核病诊断中的应用[J].北京医学，2012，34（9）：840-842.

[15] Janssens J P，Roux-Lombard P，Perneger T，et al.Quantitative scoring of an interferon-assay for differentiating active from latent tuberculosis[J].Eur Respir J，2007，30（4）：722-728.

[16]李志惠，张红漫，刘建强，等.荧光定量PCR测定支气管肺泡灌洗液中TbDNA诊断肺结核的临床价值[J].中国抗痨杂志，2010，32（10）：634-636.

[17]廖明，刘琳，杨明炜.血TSPOT.TB联合肺泡灌洗液TBDNA检测对诊断肺结核的应用价值[J]临床肺科杂志，2014，19（12）：2249-2252.

[18]魏巍，覃林珍，刘守江，等.实时荧光聚合酶链反应检测支气管肺泡灌洗液结核分枝杆菌DNA诊断肺结核价值[J].临床荟萃，2014，29（6）：611-613.

[19] Fei By，Lv Hx，Zheng W H.Fluorescent quantitative PCR of Mycobacterium tuberculosis for differentiating intestinal tuberculosis from Crohns disease[J].Braz J Med Biol Res，2014，47（2）：166-170.

[20] Zhao D，Yang X M，Chen Q Y，et al.A modified acid-fast staining method for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis[J].J Microbiol Methods，2012，91（1）：128-132.

[21]方涛，刘娅，刘亚莉.结核菌素试验在涂阴肺结核患者诊断中的作用[J].重庆医学，2011，40（27）：2707-2708.

（收稿日期：2017-10-13） （本文编辑：张爽）endprint