发酵底物锰含量对牦牛体外瘤胃发酵的影响

刘慧丽 薛艳锋* 郝力壮** 刘书杰** 柴沙驼 张晓卫

(1.省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，青海省高原放牧家畜动物营养与饲料科学重点实验室，西宁 810016；2.青海高原牦牛研究中心，西宁 810016；3.青海大学畜牧兽医科学院，西宁 810016)

牦牛作为高原的特有物种，在严酷的自然环境下具有高免疫性、抗逆性和快速适应性等特点[1]，其绒、乳、肉等为牧民提供了主要的物质生活资料。一直以来，牦牛的生存主要依靠于天然草场，低产犊率、低生长速率、冷季掉膘严重等问题严重制约着牦牛产业的发展。因此近些年来，牦牛的冷季补饲越来越受到研究者和牧民的关注，科学配制牦牛饲粮也显得尤为重要。关于牦牛能量和蛋白质营养方面已经有一定量的研究[2-3]，但是关于牦牛微量元素锰方面的研究基本上处于空白状态。锰作为微量元素的一种，是动物生命活动中所必需的微量元素之一。锰能促进骨骼发育[4-5]，参与造血[6]，增强细胞免疫功能[7-8]，是很多酶类的组成成分[9]。郗丽兰[10]报道，牛对饲粮锰的需要量为46.40～48.40 mg/kg。庄怀飞等[11]研究了不同饲粮锰、铜含量下荷斯坦公牛抗氧化指标的变化，结果表明饲粮锰的适宜含量为50.00 mg/kg。纪守坤等[12]的研究表明，公羔羊和母羔羊对锰的维持需要量分别为0.29和0.22 g/d，折算成每千克饲粮干物质大约分别为116和88 mg/kg。本研究通过体外瘤胃发酵技术探究35～70 mg/kg的甘氨酸锰对生长期牦牛瘤胃发酵的影响，旨在得出生长期牦牛饲粮中锰微量元素的适宜含量，进而完善牦牛饲养标准，为科学地配制牦牛补饲饲粮提供理论依据，促进牦牛产业的发展。

1 材料与方法

1.1 试验动物与饲养管理

选择3头健康、体况接近、装有永久性瘤胃瘘管的大通阉牦牛作为试验动物。试验饲粮包括精料和粗料(燕麦青干草)，精粗比60∶40，单头饲喂，每日2次(08:00、18:00)，自由饮水。预饲15 d之后，清晨空腹采集瘤胃液。

1.2 发酵底物

参考我国《肉牛饲养标准》(NY/T 815—2004)和文献[13]，按照150 kg牦牛日增重500 g设计牦牛基础饲粮，以燕麦青干草作为粗料，精粗比为60∶40，以此饲粮为发酵底物，发酵底物组成及营养水平见表1。

表1 发酵底物组成及营养水平(干物质基础)

1.3 试验设计

采用单因素试验设计，共5个处理，每个处理设3个重复。以甘氨酸锰(由长沙兴嘉生物工程有限公司提供，纯度为21%，产品编号2015071810)形式在发酵底物中添加锰，使锰含量分别达到35.00、40.00、50.00、60.00、70.00 mg/kg(干物质基础)，其他微量元素铁、锌、硒、铜的含量一致，分别为5.26、6.27、0.04、4.40 mg/kg(干物质基础)。

1.4 体外瘤胃发酵

按照Menke等[14]的方法制备人工瘤胃液，按照表2中各溶液的配方分别配制微量元素溶液(A液)，缓冲液(B液)，常量元素溶液(C液)，指示剂和还原液。按照顺序依次向2 L的玻璃广口瓶中加入667 mL的超纯水，0.17 mL的A液，333 mL的B液，333 mL的C液，1.70 mL的指示剂，67 mL的还原液，配制人工瘤胃液。30 mL人工瘤胃液和200 mg发酵底物共同装入发酵管中，放入人工瘤胃培养箱，(39±0.5) ℃开始发酵[15-16]，分别在培养2、4、6、8、12、14、16、24、30、36、48 h读取每个发酵培养管的刻度并记录。

表2 人工瘤胃液各单一溶液的配方

1.5 测定指标与测定方法

1.5.1 锰含量的测定

锰含量参考GB/T 13885—2003[17]测定，使用TAS-990原子吸收分光光度计测定发酵底物中微量元素锰含量。锰含量标准曲线为：

Abs=0.182 90Conc.+0.003 140 0
(r=0.999 7，n=4)。

式中：Conc.为锰含量(μg/mL)；Abs为279.5 nm处的吸光度值。

1.5.2 产气量、pH、干物质消失率(DMD)及微生物蛋白质(MCP)和氨态氮(NH3-N)含量的测定

发酵底物产气量和DMD采用以下公式计算：

产气量(mL)=某时间点培养管
产气量(mL)-对应时间点
空白管产气量(mL)；DMD(%)=[(样本DM重-残渣DM重+
空白管DM重)/样本DM重]×100。

发酵液pH的测定使用HANNA-HI221高精密酸度计进行。发酵液MCP含量用南京建成生物研究所提供的试剂盒测定。发酵液NH3-N含量采用冯宗慈等[18]改进的比色法测定。

1.5.3 甲烷产量、VFA含量的测定

甲烷产量参考文献[19-20]测定，使用气相色谱仪(GC-2014，日本岛津公司)测定体外瘤胃发酵所产生的气体中的甲烷含量，进而计算甲烷产量。测定条件：火焰氢离子检测器(FID)，色谱柱为毛细管柱(FFAP,30.00 m×0.32 mm,0.50 μm)；色谱柱温度为100 ℃，恒温模式；汽化室温度100 ℃；FID温度110 ℃；进样量100 μL；载气为高纯氮气(99.99%)，压力0.7 MPa；氢气压力0.4 MPa，空气压力0.4 MPa；毛细管柱压力65 kPa，分流比40∶1。

本试验所使用的甲烷标准气体委托兰州华特化工供应站生产，气体成分如表3所示。

表3 甲烷标准气体成分

本试验所拟合的甲烷标准曲线为Y=249 833X+78 225.5(r=0.999)[Y为进样的峰面积，X为甲烷含量(mmol/L)]。

VFA含量参考文献[21-22]测定。样品的前处理：发酵液经4层纱布过滤后，取5 mL于干净的离心管中，3 000 r/min离心10 min，取上清液2 mL于离心管中，准确加入0.2 mL、25%的偏磷酸溶液，混匀之后，静置10 min充分反应，之后在12 000 r/min、4 ℃的条件下离心10 min，转移上清到新的离心管中，-80 ℃冻存，备用。

用气相色谱仪测定VFA含量。测定条件：FID，色谱柱为毛细管柱(FFAP，30.00 m×0.32 mm，0.50 μm)；色谱柱升温程序，初始60 ℃，以10 ℃/min升温至120 ℃，保留2 min，以15 ℃/min升温至180 ℃，保留5 min；汽化室温度250 ℃；FID温度250 ℃；进样量1 μL，载气为高纯氮气(99.99%)，压力0.7 MPa；氢气压力0.4 MPa，空气压力0.4 MPa，毛细管柱压力0.6～0.8 MPa，分流比40∶1。本试验所拟合的VFA含量标准曲线见表4。

1.5.4 淀粉酶(AMS)、脂肪酶(LPS)、胰蛋白酶(TYS)和纤维素酶(CLS)活力的测定

AMS、LPS、TYS和CLS活力测定用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒。单位定义：每毫升含酶溶液在37 ℃下与底物作用30 min，水解10 mg淀粉定义为1个AMS活力单位；每毫升含酶溶液在37 ℃下与底物反应1 min，每消耗1 μmol底物定义为1个LPS活力单位；每毫升含酶溶液在pH 8.0、37 ℃的条件下，每分钟使反应体系的吸光度值变化0.003定义为1个TYS活力单位；每毫升含酶溶液每分钟催化产生1 μg葡萄糖定义为1个CLS活力单位。

表4 VFA含量标准曲线

Y为进样的峰面积，X为组分含量(mmol/L)。

Ywas peak area of sample， andXwas component content (mmol/L).

1.6 统计分析

采用Excel 2007进行数据的初步整理，采用SAS 9.1.3软件中ANOVA程序进行单因素方差分析，采用Duncan氏法进行多重比较。试验数据均以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 产气量、甲烷产量、DMD及发酵液pH

从表5中可以看出，随着锰含量的升高，产气量呈现降低趋势，发酵液pH呈现升高趋势，DMD呈现先上升后下降的趋势。产气量在锰含量为35.00 mg/kg时处于最高值73.80 mL，在锰含量为40.00 mg/kg时处于次高值72.80 mL，锰含量为35.00、40.00、50.00和60.00 mg/kg时产气量差异

不显著(P>0.05)，但这4个处理均显著高于锰含量为70.00 mg/kg时(P<0.05)。甲烷产量在锰含量为60.00 mg/kg时达到最大值8.01 mL，显著高于锰含量为35.00、40.00和50.00 mg/kg时(P<0.05)，但与锰含量为70.00 mg/kg时差异不显著(P>0.05)。DMD在锰含量为60.00 mg/kg时达到最大值68.73%，显著高于锰含量为35.00和70.00 mg/kg时(P<0.05)，但与锰含量为40.00和50.00 mg/kg时差异不显著(P>0.05)。发酵液pH在锰含量为70.00 mg/kg时达到最大值7.49(P<0.05)，显著高于锰含量为35.00和40.00 mg/kg时(P<0.05)，但与锰含量为50.00和60.00 mg/kg时差异不显著(P>0.05)。

表5 发酵底物锰含量对体外瘤胃发酵产气量、甲烷产量、DMD及发酵液pH的影响

同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同或无小写字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same small or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 发酵液NH3-N和MCP含量

从表6中可以看出，随着锰含量的升高，发酵液NH3-N和MCP含量呈现先上升后下降的趋势。发酵液NH3-N含量在锰含量为40.00 mg/kg时达到最大值10.60 mg/dL，显著高于锰含量为50.00、60.00和70.00 mg/kg时(P<0.05)，但与锰含量为35.00 mg/kg时差异不显著(P>0.05)。发酵液MCP含量在锰含量为40.00 mg/kg时达到最大值3.90 g/L，显著高于锰含量为35.00、60.00和70.00 mg/kg时(P<0.05)，但与锰含量为50.00 mg/kg时差异不显著(P>0.05)。

表6 发酵底物锰含量对体外瘤胃发酵发酵液NH3-N和MCP含量的影响

2.3 发酵液消化酶活力

从表7中可以看出，随着锰含量的升高，发酵液AMS、LPS、TYS活力呈现先上升后下降的趋势，发酵液CLS活力呈现上升趋势。发酵液AMS活力在锰含量为60.00 mg/kg时达到最大值0.51 U/mL，显著高于锰含量为35.00、40.00和50.00 mg/kg时(P<0.05)，但与锰含量为70.00 mg/kg时差异不显著(P>0.05)；发酵液LPS活力在锰含量为50.00 mg/kg时达到最大值0.50 U/mL，显著高于其他处理(P<0.05)，锰含量

为40.00、60.00和70.00 mg/kg时差异不显著(P>0.05)，但显著高于锰含量为35.00 mg/kg时(P<0.05)；发酵液TYS活力在锰含量60.00 mg/kg时达到最大值65.46 U/mL，显著高于锰含量为35.00 mg/kg、70.00 mg/kg时(P<0.05)，但与锰含量为40.00 mg/kg、50.00 mg/kg时差异不显著(P>0.05)。发酵液CLS活力各处理间差异不显著(P>0.05)，在锰含量为70.00 mg/kg时达到最大值81.12 U/mL。

2.4 发酵液VFA含量

从表8中可以看出，随着锰含量的升高，发酵液乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、总挥发性脂肪酸的含量都呈现先上升后下降的趋势。发酵液乙酸含量在锰含量为40.00 mg/kg时达到最大值47.12 mmol/L，显著高于锰含量为50.00、60.00和70.00 mg/kg时(P<0.05)，但与锰含量为35.00 mg/kg时差异不显著(P>0.05)；发酵液丙酸含量各处理间差异不显著(P>0.05)，在锰含量为40.00 mg/kg时达到最大值19.45 mmol/L；发酵液异丁酸含量各处理间差异不显著(P>0.05)，在锰含量为40.00 mg/kg时达到最大值0.35 mmol/L；发酵液丁酸含量各处理间差异不显著(P>0.05)，在锰含量为40.00 mg/kg时达到最大值5.41 mmol/L；发酵液异戊酸含量各处理间差异不显著(P>0.05)，在锰含量为40.00 mg/kg时达到最大值0.96 mmol/L；发酵液戊酸含量各处理间差异不显著(P>0.05)，在锰含量为40.00 mg/kg时达到最大值0.50 mmol/L；发酵液总挥发性脂肪酸含量在锰含量为40.00 mg/kg时达到最大值72.24 mmol/L，显著高于锰含量为60.00和70.00 mg/kg时(P<0.05)，但与锰含量为35.00和50.00 mg/kg时差异不显著(P>0.05)；发酵液乙酸/丙酸在锰含量为50.00 mg/kg时达到最小值2.05，显著低于锰含量为35.00、40.00和60.00 mg/kg时(P<0.05)，但与锰含量为70.00 mg/kg时差异不显著(P>0.05)。

表8 发酵底物锰含量对体外瘤胃发酵发酵液VFA含量的影响

3 讨 论

瘤胃发酵产气量的多少反映饲粮的降解程度[23]，产气量越高，表明饲粮发酵越充分，为机体提供的能量越多，越有利于动物的生长。本试验中产气量在锰含量为35.00 mg/kg时处于最高值，随着锰含量的增加，产气量逐渐降低，说明锰含量越高，越不利于瘤胃发酵。甲烷产量在锰含量为60.00 mg/kg时达到最高值。产气量降低，甲烷产量反而升高，意味着能量损失增大。在锰含量为60.00 mg/kg时，甲烷产量达到最高，为8.01 mL，高效酸丙酸的含量达到最低，为12.71 mmol/L，乙酸/丙酸达到最大,为2.87，表明锰含量为60.00 mg/kg时不利于动物生长。从发酵液MCP含量结果来看，也恰恰证明了这一点，在锰含量为60.00 mg/kg时，发酵液MCP含量较低，此时瘤胃微生物活力低。pH是瘤胃发酵的综合反映，受发酵底物类型、有机酸沉淀等各种因素的影响[24]，只有当pH处于正常范围之内，才能够保证瘤胃发酵、饲料降解的正常进行。本试验不同锰含量下体外瘤胃发酵后的发酵液pH在7.03～7.49，属正常范围(5.60～7.50)。

DMD直接反映饲粮在瘤胃中的降解程度。本试验中，DMD随锰含量的升高呈现先上升后下降的趋势，在锰含量为60.00 mg/kg时达到最大值68.73%。由此可见，锰含量为60.00 mg/kg时最有利于饲料的降解。锰可以显著促进瘤胃微生物对纤维素的降解。Martinez等[25]研究表明，底物中锰含量为5.00～30.00 mg/L时，都能促进瘤胃微生物降解纤维素，而其中锰含量为15.00 mg/L时效果最佳。黄静龙[26]研究表明，40.00 mg/kg锰组的饲粮表观消化率显著高于120.00 mg/kg锰组和160.00 mg/kg锰组。DMD的结果与瘤胃消化道酶活力的测定结果基本吻合，发酵液AMS、LPS、TYS活力随锰含量的升高呈现先上升后下降的趋势，只有发酵液CLS活力随锰含量的升高呈现持续升高的趋势，并且都在锰含量为40.00～60.00 mg/kg时处于较高水平。因此从瘤胃消化酶活力和DMD的角度看，当锰的含量在40.00～60.00 mg/kg时，最有利于饲粮的降解。

NH3-N来源于饲粮中蛋白质的降解，主要用于微生物合成MCP[27]，在瘤胃中基本处于动态平衡。本试验中的发酵液NH3-N含量在6.42～10.60 mg/dL，都处于正常范围(0.35～29.00 mg/dL[28-29])。发酵液NH3-N含量随着锰含量的升高呈现先上升后下降的趋势，并且在锰含量为40.00 mg/kg时达到最高值。MCP提供了反刍动物机体40%～60%的蛋白质需要量。发酵液MCP含量随着锰含量的升高呈现先上升后下降的趋势，且在锰含量为40.00 mg/kg时达到最大值。由此可见，锰含量为40.00 mg/kg时，最有利于NH3-N和MCP的形成。

VFA是反刍动物重要的能量物质，提供了反刍动物60%～80%的消化能[30-31]。乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、总挥发性脂肪酸的含量都随着锰含量的升高呈现先上升后下降的趋势，都在锰含量为40.00 mg/kg时达到最高值，并且都在锰含量为35.00～50.00 mg/kg时处于较高水平。同时，对于反刍动物来说，为机体提供能量的物质主要是来源于肝脏组织中糖异生作用产生的葡萄糖，而丙酸是糖异生作用的重要前体物质，是一种高效酸，乙酸/丙酸越低，表明丙酸所占比例也越大，越利于反刍动物的生长。本试验中乙酸/丙酸在锰含量为50.00 mg/kg时达到最低值2.05，最有利于瘤胃发酵过程中高效酸丙酸的生成。因此，从挥发性脂肪酸的角度看，当锰含量为35.00～50.00 mg/kg时，有利于瘤胃发酵能量物质的生成。

4 结 论

① 对于生长期牦牛，若以甘氨酸锰作为锰元素添加形式，推荐牦牛饲粮锰含量在40.00～50.00 mg/kg，有利于瘤胃发酵和饲草料降解。

② 根据现有资料设定的牦牛饲粮中锰含量只有33.82 mg/kg，远低于牦牛对锰的需要量40.00～50.00 mg/kg，处于极度缺乏状态，必须额外补充微量元素锰，才能改善牦牛瘤胃发酵，提高生长性能。

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*Contributed equally

**Corresponding authors: HAO Lizhuang, associate professor, E-mail: lizhuanghao1122@foxmail.com; LIU Shujie, professor, E-mail: mkylshj@126.com