皇竹草与喷浆玉米皮组合效应的研究

吴征敏 王志敬,2* 于 辉 吴浩浩 苏智杰 林敏纯 曾 进 尹福泉** 赵志辉

(1.广东海洋大学农学院，湛江 524088；2.衡阳德邦新金生物科技有限公司，衡阳 421001；3.佛山科学技术学院生命科学与工程学院，佛山 528231)

皇竹草(PennisetumsineseRoxb，PSR)，又称王草、皇竹，为多年生禾本科植物，因质优、高产、营养丰富等优点，被称为饲草之王[1]，在我国南方热带亚热带地区广泛种植；喷浆玉米皮(spouting corn bran，SCB)，又称玉米麸或玉米蛋白质饲料，是在玉米淀粉生产过程中将蛋白质含量及能量高的玉米浆喷洒到玉米皮上，经滚筒干燥而形成的玉米加工副产物，所含蛋白质、氨基酸及能量均较玉米皮高，具有色泽好、能量高、消化率高等特点[2]。李姗姗等[3]研究表明，在华农肉鸭饲粮中添加5%～10%的喷浆玉米皮，对15日龄以后的华农肉鸭生产性能及肠道发育无不良影响；舒维成等[4]研究表明，在樱桃谷鸭饲粮中添加5%的喷浆玉米皮，对樱桃谷鸭的生产性能及肠道发育无显著影响；孟梅娟等[5]研究表明，喷浆玉米皮与小麦秸秆以25∶75组合，能产生最大正组合效应，提高营养物质降解率；涂远璐等[6]研究表明，在小麦秸与喷浆玉米皮组合中，随喷浆玉米皮比例的增加，丙酸浓度增加，提高了饲料的转化效率，更适合家禽育肥等，可利用不同饲料之间产生的正组合效应，提高饲料转换率，以达到均衡营养的目的。通过前人研究可以看出，喷浆玉米皮作为非常规饲料原料在动物生产中应用具有可行性，但关于喷浆玉米皮在南方地区的应用效果，尤其是与南方牧草的组合效果鲜有报道。本试验在前人研究的基础上，选择皇竹草和喷浆玉米皮按不同比例组合作为发酵底料，采用体外产气法研究该组合对山羊瘤胃降解率的影响，筛选出较为合理的组合比例，从而为南方粗饲料资源的科学应用提供理论依据和数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料和试验动物

皇竹草：于2016年10月份，在株高150～200 cm时进行收割，留茬20 cm，用揉草机揉搓粉碎，于60 ℃烘箱烘干后，用微型粉碎机粉碎后备用。

喷浆玉米皮：由湛江市某饲料公司提供。

试验动物：以山羊作为瘤胃液供体羊。

1.2 试验设计

试验采用体外产气法，以不同比例组合的皇竹草与喷浆玉米皮作为发酵底料，皇竹草与喷浆玉米皮按干物质(DM)比例为100∶0、75∶25、50∶50、25∶75和0∶100分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组，每个时间点设置3个重复和2个空白对照。分别培养4、8、12、24和48 h，测定各时间点发酵液及发酵滤渣的各项指标。试验原料的营养水平如表1。

表1 试验原料的营养水平(干物质基础)

1.3 发酵液制备

1.3.1 人工唾液原液的配制

A液(微量元素溶液)：CaCl2·2H2O 13.2 g、CoCl3·6H2O 1.0 g、MnCl2·4H2O 10.0 g、FeCl3·6H2O 8.0 g，加蒸馏水至100 mL。

B液(缓冲液)：NH4HCO34.0 g、NaHCO335.0 g，加蒸馏水至1 000 mL。

C液(常量元素溶液)：NaH2PO4·12H2O 9.45 g、MgSO4·7H2O 0.6 g、KH2PO46.2 g，加蒸馏水至1 000 mL。

D液(0.1%刃天青溶液)：100 mg刃天青溶解于100 mL蒸馏水。

E液(还原剂溶液)：蒸馏水95 mL、Na2S·9H2O 625 mg、1 mol/L NaOH 4.0 mL。

1.3.2 人工唾液制备

将配制好的原液以配制1 000 mL人工唾液加蒸馏水520.3 mL、B液208.1 mL、C液208.1 mL、A液0.1 mL、D液1 mL、E液62.4 mL的比例混合均匀，放入(39.0±0.5) ℃恒温水浴锅内，不间断的通入CO2使其由蓝色变为粉红色，最终为无色，制成人工唾液。

1.3.3 瘤胃液采集

晨饲前，取山羊瘤胃液置于保温壶内带到实验室，倒入烧杯内放入(39.0±0.5) ℃的水浴锅内，依次用2、4和6层纱布过滤，滤液不间断的通入CO2气体。将瘤胃液与人工唾液按1∶9的体积比混合，加入到体积为200 mL装有1.25 g发酵底物的产气瓶内，放入(39.0±0.5) ℃的恒温振动培养箱内分别培养4、8、12、24和48 h。

1.4 样品采集与处理

将各时间点产气瓶取出后，迅速放入冰水终止微生物活动，立即用S220-K型酸度计测得发酵液pH。经尼龙布过滤，滤液置于-20 ℃冰箱保存，用于氨态氮(NH3-N)浓度的测定；滤渣放入65 ℃烘箱内烘干，称重后置于-20 ℃冰箱保存，待测。

1.5 测定指标与方法

试验原料和滤渣的DM、粗灰分(Ash)、粗蛋白质(CP)含量按照AOAC(1995)[7]常规方法测定，酸性洗涤纤维(ADF)和中性洗涤纤维(NDF)含量采用范氏(Van Soest)洗涤纤维法测定。采用朱文涛等[8]的方法测定发酵液中NH3-N浓度。

1.6 指标计算

1.6.1 养分降解率的计算

某养分降解率(%)=[(试验原料中
某养分含量-残渣中某养分含量)/
试验原料中某养分含量]×100。

1.6.2 组合效应值的计算

组合效应值(%)=[(实测值-加权估计值)/
加权估计值]×100。

式中：实测值为实际测定样品某养分的降解率；加权估计值：A样品实测值×A样品配比+B样品实测值×B样品配比。

1.7 数据处理

试验数据用Excel 2013初步整理，采用SPSS 20.0软件中的ANOVA模型进行单因素方差分析，用LSD法进行多重比较；结果用“平均值±标准差”表示，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 皇竹草与喷浆玉米皮组合对发酵液pH和NH3-N浓度的影响

由表2可知，在体外发酵4 h时，随着组合中喷浆玉米皮比例的增加，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组发酵液的pH显著低于发酵底物为单一皇竹草的Ⅰ组(P<0.05)；在体外发酵8、12、24和48 h时，随着组合中喷浆玉米皮比例的增加，发酵液的pH显著降低(P<0.05)。在整个发酵期，随着发酵时间的延长，各组发酵液的pH均显著降低(P<0.05)。

表2 皇竹草与喷浆玉米皮组合对发酵液pH的影响

同列数据肩标无字母或相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；同行数据肩标无字母或相同大写字母表示差异不显著(P>0.05)，不同大写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

In the same column, values with no letter or the same small letter superscripts mean no significant difference(P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference(P<0.05); in the same row, values with no letter or the same capital letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

由表3可知，在体外发酵4 h时，随着组合中喷浆玉米皮比例的增加，各组发酵液中NH3-N浓度差异不显著(P>0.05)；在体外发酵8 h时，Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ组发酵液中NH3-N浓度显著低于Ⅰ组(P<0.05)，Ⅲ组与Ⅰ组差异不显著(P>0.05)；在体外发酵12 h时，Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组发酵液中NH3-N浓度显著高于Ⅰ组(P<0.05)；在体外发酵24 h时，随着组合喷浆玉米皮比例的增加，发酵液中NH3-N浓度逐渐增大，Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组显著高于Ⅰ和Ⅱ组(P<0.05)，Ⅳ和Ⅴ组显著高于Ⅲ组(P<0.05)；在体外发酵48 h时，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组发酵液中NH3-N浓度随喷浆玉米皮比例的增加而显著增加(P<0.05)，Ⅴ组较Ⅳ组略有增加(P>0.05)。在整个发酵期间，Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组发酵液中NH3-N浓度随着发酵时间的延长呈先降低后升高趋势。

表3 皇竹草与喷浆玉米皮组合对发酵液中NH3-N浓度的影响

2.2 皇竹草与喷浆玉米皮组合对山羊体外瘤胃DM降解率的影响

由表4可知，在体外发酵4 h时，随着组合中喷浆玉米皮比例的增加，各组合山羊体外瘤胃DM降解率无显著差异(P>0.05)；在体外发酵8 h时，随着组合中喷浆玉米皮比例的增加，山羊体外瘤胃DM降解率逐渐升高，除Ⅳ和Ⅴ组间差异不显著(P>0.05)外，其他组间差异显著(P<0.05)；在体外发酵12和48 h时，山羊体外瘤胃DM降解率随着组合中喷浆玉米皮比例的增加而显著升高(P<0.05)；在体外发酵24 h时，随着组合中喷浆玉米皮比例的增加，山羊体外瘤胃DM降解率逐渐升高，除Ⅲ和Ⅳ组间差异不显著(P>0.05)外，其他组间差异显著(P<0.05)。在整个发酵期间，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组山羊体外瘤胃DM降解率随发酵时间的延长显著升高(P<0.05)。

表4 皇竹草与喷浆玉米皮组合对山羊体外瘤胃DM降解率的影响

2.3 皇竹草与喷浆玉米皮组合对山羊体外瘤胃DM降解率的组合效应

由表5可知，皇竹草与喷浆玉米皮组合产生了组合效应。在体外发酵4、8和24 h时，随着组合中喷浆玉米皮比例由25%增加到50%，组合效应值呈增加趋势，但差异不显著(P>0.05)；在体外发酵12和48 h时，随着组合中喷浆玉米皮比例由25%增加到50%，组合效应值呈降低趋势，但差异不显著(P>0.05)。75%皇竹草与25%喷浆玉米皮组合、50%皇竹草与50%喷浆玉米皮组合，在整个发酵期均产生正组合效应；25%皇竹草与75%喷浆玉米皮组合，在体外发酵4和24 h时产生负组合效应，在体外发酵8、12和48 h时产生负组合效应。在整个发酵期间，随发酵时间的延长，含25%和50%喷浆玉米皮的组合均产生正组合效应。

2.4 皇竹草与喷浆玉米皮组合对山羊体外瘤胃NDF降解率的影响

由表6可知，在体外发酵4 h时，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组间山羊体外瘤胃NDF降解率差异不显著(P>0.05)，但均显著高于Ⅳ和Ⅴ组(P<0.05)；在体外发酵8 h时，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组山羊体外瘤胃NDF降解率显著高于Ⅰ组(P<0.05)；在体外发酵12、48 h时，随着组合中喷浆玉米皮比例的增加，山羊体外瘤胃NDF降解率呈升高趋势，除Ⅲ与Ⅳ组差异不显著(P>0.05)外，其他组间差异显著(P<0.05)；在体外发酵24 h时，随着组合中喷浆玉米皮比例的增加，山羊体外瘤胃NDF降解率呈升高趋势，除Ⅱ与Ⅲ组差异不显著(P>0.05)外，其他组间差异显著(P<0.05)。在整个发酵期间，随发酵时间的延长，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组山羊体外瘤胃NDF降解率显著升高(P<0.05)。在体外发酵4～12 h时，Ⅰ组山羊体外NDF降解率无显著变化(P>0.05)；在体外发酵12～48 h时，山羊体外NDF降解率显著升高(P<0.05)。

表5 皇竹草与喷浆玉米皮组合对山羊体外瘤胃DM降解率的组合效应

表6 皇竹草与喷浆玉米皮组合对山羊体外瘤胃NDF降解率的影响

2.5 皇竹草与喷浆玉米皮组合对山羊体外瘤胃NDF降解率的组合效应

由表7可知，皇竹草与喷浆玉米皮组合产生了组合效应。在体外发酵4 h时，随着组合中喷浆玉米皮比例的增加，组合效应值逐渐减小，Ⅱ与Ⅲ组显著高于Ⅳ组(P<0.05)；在体外发酵8、12、24和48 h时，随着组合中喷浆玉米皮比例的增加，组合效应值逐渐减小，Ⅱ组显著高于Ⅲ、Ⅳ组(P<0.05)。75%皇竹草与25%喷浆玉米皮组合，在整

个发酵期内均产生正组合效应；50%皇竹草与50%喷浆玉米皮组合，在体外发酵4、12、24 h时均产生正组合效应，在体外发酵48 h时产生负组合效应；25%皇竹草与75%喷浆玉米皮组合，在体外发酵4、12、24和48 h时均产生负组合效应，在体外发酵8 h时产生正组合效应。在整个发酵期间，随发酵时间的延长，Ⅱ组的组合效应值呈先增大后降低趋势，Ⅲ组的组合效应值逐渐降低。

表7 皇竹草与喷浆玉米皮组合对山羊体外瘤胃NDF降解率的组合效应

2.6 皇竹草与喷浆玉米皮组合对山羊体外瘤胃CP降解率的影响

由表8可知，在体外发酵4 h时，随着组合中喷浆玉米皮比例的增加，山羊体外瘤胃CP降解率呈先增高后降低趋势，以Ⅲ组最高，显著高于其他各组(P<0.05)；在体外发酵8 h时，添加喷浆玉米皮组(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组)山羊体外瘤胃CP降解率均显著高于单一皇竹草组(Ⅰ组)；在体外发酵12 h时，山羊体外瘤胃CP降解率除Ⅲ与Ⅳ组间差异不显著(P>0.05)外，其他组间差异显著(P<0.05)；在体外发酵24 h时，山羊体外瘤胃CP降解

率Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组间差异不显著(P>0.05)，但上述3组均高于显著Ⅰ组(P<0.05)，且Ⅴ组显著高于除Ⅲ组外的其他各组(P<0.05)；在体外发酵48 h时，山羊体外瘤胃CP降解率组间差异显著(P<0.05)，其中Ⅲ组显著高于Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ组(P<0.05)，Ⅴ组显著高于其他各组(P<0.05)。在整个发酵期间，Ⅰ、Ⅱ组山羊体外瘤胃CP降解率随发酵时间的延长呈先升高后降低的趋势且均在体外发酵24 h时有最大值；Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组山羊体外瘤胃CP降解率则随发酵时间的延长显著增加(P<0.05)。

表8 皇竹草与喷浆玉米皮组合对山羊体外瘤胃CP降解率的影响

2.7 皇竹草与喷浆玉米皮组合对山羊体外瘤胃CP降解率的组合效应

由表9可知，皇竹草与喷浆玉米皮组合产生了组合效应。在体外发酵4、12 h时，随着组合中喷浆玉米皮比例的增加，组合效应值先增大后减小，Ⅲ组显著高于Ⅱ和Ⅳ组(P<0.05)；在体外发酵24、48 h时，随着组合中喷浆玉米皮比例的增加，组合效应值呈下降趋势，Ⅱ和Ⅲ组间差异不显著(P>0.05)，Ⅱ和Ⅲ组显著高于Ⅳ组(P<0.05)；在体外发酵8 h时，随着组合中喷浆玉米皮比例的增加，组合效应值先增大后减小，组间差异显著(P<0.05)。75%皇竹草与25%喷浆玉米皮组合、25%皇竹草与75%喷浆玉米皮组合，在体外发酵12 h时产生负组合效应，在体外发酵4、8、24、48 h时产生正组合效应；50%皇竹草与50%喷浆玉米皮组合，在整个发酵期内均产生正组合效应。在整个发酵期间，随发酵时间的延长，Ⅱ和Ⅲ组的组合效应值呈升高、降低和再升高趋势。

表9 皇竹草与喷浆玉米皮组合对山羊体外瘤胃CP降解率的组合效应

3 讨 论

3.1 皇竹草与喷浆玉米皮组合对发酵液pH和NH3-N浓度的影响

pH是最直观和最基本的反映瘤胃发酵是否正常的生理指标，综合反映瘤胃微生物代谢产物有机酸产生、吸收、排出及中和的情况，变动范围一般在5.0～7.5，瘤胃微生物的适宜pH范围在6.2～7.0，当pH低于6.2时，瘤胃内纤维素分解菌的活性会受到抑制[9]。本试验中皇竹草与喷浆玉米皮以75∶25、50∶50、25∶75比例组合，在体外发酵4～48 h时各组发酵液pH均介于6.21～7.04，说明不同比例的皇竹草与喷浆玉米皮组合在瘤胃内均可正常发酵。

NH3-N是饲料蛋白质、内源性蛋白质及非蛋白氮的降解产物，也是菌体蛋白的合成原料，其浓度可在一定程度上反映瘤胃微生物产生NH3-N及其利用情况，NH3-N浓度过高或过低都不利于瘤胃微生物的增殖[10]。本试验中，在体外发酵4～48 h时各组发酵液NH3-N浓度介于6.87～22.28 mg/dL，均在Illius[11]研究报道的瘤胃NH3-N正常浓度范围(6～30 mg/dL)之内，说明皇竹草与喷浆玉米皮组合发酵后有利于瘤胃微生物的增殖，增加了菌体蛋白的合成量，提高了蛋白质的利用率。本试验中，在体外发酵4～24 h内，各组发酵液NH3-N浓度随发酵时间的延长逐渐降低，可能是因为喷浆玉米皮属于较易降解物质，随着较易降解物质比例的增加，使得瘤胃微生物可利用营养物质增加，有利于瘤胃微生物的生长、促进了瘤胃微生物增殖，有较多的氮被微生物利用合成菌体蛋白造成的[12]；后期NH3-N浓度有上升趋势，可能是随着发酵时间的延长，发酵瓶内发酵产物逐渐积累无法转移出去，致使氨在发酵瓶内积累造成的[13]。

3.2 皇竹草与喷浆玉米皮组合对山羊体外瘤胃DM降解率的影响

本试验通过研究不同比例皇竹草与喷浆玉米皮组合对山羊体外瘤胃DM降解率的影响后发现，随皇竹草与喷浆玉米皮组合比例的变化，山羊体外瘤胃DM降解率也在发生改变，说明不同粗饲料组合产生了组合效应，这与高立鹏等[14]和孟梅娟等[15]研究结果一致。本试验中，随着组合中喷浆玉米皮比例的增加，山羊体外瘤胃DM降解率逐渐增加，当喷浆玉米皮添加比例达到50%时，山羊体外瘤胃DM降解率增加幅度有所降低，这与张颖等[16]研究稻草与苜蓿组合，当苜蓿添加比例达到30%时，瘤胃DM降解率增加幅度减小，瘤胃基本处于降解极限状态的结果一致。总体来看，各皇竹草与喷浆玉米皮组合组后山羊体外瘤胃DM降解率均显著高于单一皇竹草组，说明皇竹草与喷浆玉米皮之间存在组合效应，这可能是因为粗饲料来源及牧草自身所含DM、CP和CF等不同，粗饲料适口性不同，在瘤胃内降解特性不同造成的[17]。本试验中，随着发酵时间的延长，各组山羊体外瘤胃DM降解率显著升高，可能是由于发酵时间延长，瘤胃微生物分解菌活性增强，营养物质降解程度加大所致。组合中添加25%和50%喷浆玉米皮组均产生不同程度的正组合效应，说明添加一定比例的喷浆玉米皮有利于瘤胃微生物的增殖，增加瘤胃营养物质的消化吸收。

DM降解率是反映粗饲料瘤胃发酵特性的重要指标之一[18]，粗饲料进入瘤胃后，经瘤胃微生物作用，产生挥发性脂肪酸、NH3-N等，在微生物作用下以NH3-N、酮酸为原料合成菌体蛋白，可为反刍动物提供所需蛋白质的40%～80%。粗饲料组合的优劣不仅与饲料中营养成分的含量和质量有关，还与饲料中营养成分的结构有关[19]。巴桑珠扎等[20]研究表明，不同作物秸秆其DM降解率不同，可能与不同作物秸秆中可消化有机物及非结构性碳水化合物含量有关。本试验中，随着组合中喷浆玉米皮比例的增加，山羊体外瘤胃DM降解率升高，可能是由于喷浆玉米皮中的可消化有机物及非结构性碳水化合物含量较高造成的。

3.3 皇竹草与喷浆玉米皮组合对山羊体外瘤胃纤维降解率的影响

粗纤维是反刍动物必需的营养素之一，它可以为反刍动物提供挥发性脂肪酸、糖原异生的前提物质，为动物提供大量能源、维持动物正常的生产功能及瘤胃的正常功能和动物的健康[21]。NDF能够通过刺激反刍动物的咀嚼和反刍，促进动物唾液分泌，提高瘤胃的缓冲能力，对保护反刍动物胃肠道健康和维持瘤胃正常发酵具有重要意义[22]。本试验中，在体外发酵8～48 h内，添加喷浆玉米皮的组山羊体外瘤胃NDF降解率均高于单一皇竹草组，这与夏科等[23]和Ponce等[24]的研究结果一致。添加喷浆玉米皮组山羊体外瘤胃NDF降解率可能是因为喷浆玉米皮中蛋白质含量较高，为瘤胃微生物生长提供了所需要的氨氮、肽与氨基酸及支链脂肪酸等[5]。研究表明，向低蛋白质饲粮中添加支链脂肪酸有利于增加瘤胃微生物总数与菌体蛋白总量[25-27]，进而促进纤维物质的降解[28]。本试验中，在皇竹草中添加不同比例的喷浆玉米皮能够产生不同程度的组合效应，说明添加喷浆玉米皮有利于瘤胃微生物的生长繁殖，提高了营养物质的降解率。本试验中，75%皇竹草与25%喷浆玉米皮组合在整个发酵期内均产生正组合效应，且在体外发酵12 h时组合效应值达到最大；50%皇竹草与50%喷浆玉米皮组合在体外发酵48 h时产生负组合效应；25%皇竹草与75%喷浆玉米皮组合在整个发酵期内均产生不同程度的负组合效应等，这可能是由于在皇竹草中添加适宜比例的非常规饲料可以提高皇竹草中纤维的降解率，产生正组合效应，若添加比例不适宜则会产生负组合效应[15]。

3.4 皇竹草与喷浆玉米皮组合对山羊体外瘤胃CP降解率的影响

反刍动物摄入的饲粮蛋白质，一部分在瘤胃微生物的作用下被降解，降解的蛋白质被用于合成瘤胃菌体蛋白，合成的瘤胃菌体蛋白和饲粮中非降解蛋白质进入小肠被消化、吸收和利用[29]。张永根等[30]对奶牛常用饲料中CP的瘤胃降解特性进行了研究，发现饲粮中CP降解率与饲粮中NDF和ADF含量呈显著负相关关系；本试验中发酵底物中NDF和ADF含量随喷浆玉米皮比例的增加逐渐减少，伴随着体外瘤胃CP降解率逐渐增加，与上述研究结果相符。不同饲料相互组合，由于某种相互作用使得组合后某种营养成分的降解率高于各单一饲料的加权值时，说明这种组合产生了正组合效应[31]。本试验中，皇竹草与不同比例喷浆玉米皮组合，山羊体外瘤胃CP降解率升高，出现了不同程度的正组合效应，可能是2种粗饲料组合后较单一粗饲料营养成分比例合理均衡，组合效应弥补了单一粗饲料碳氮不平衡的缺陷，提高了粗饲料中养分在瘤胃中的降解率[32]。因此，不同饲料组合研究对动物健康及饲料资源的开发利用具有重要意义。

4 结 论

① 在以皇竹草为主要粗饲料的饲粮中，添加喷浆玉米皮有利于改善饲粮营养水平，提高皇竹草的利用率。

② 从山羊体外瘤胃养分降解率的组合效应考虑，皇竹草与喷浆玉米皮的适宜组合比例为(75∶25)～(50∶50)。

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*Contributed equally

**Corresponding author, associate professor, E-mail: yinfuquan01@163.com