去乙酰化酶1在肝癌干细胞更新中的机制研究

牛静伟，张勤生，王桂菊

1. 中国人民解放军第152中心医院消化内科，河南 平顶山 467000； 2. 河南中医药大学附属第二医院肝胆脾胃科； 3. 南阳南石医院病理科

肝细胞癌(hepatocellular cancer，HCC)表现出形态学、细胞和分子异质性[1]。最近的研究已经证明,癌细胞的一个亚群-癌症干细胞(cancer stem cells，CSCs)具有增殖、自我更新并促进肿瘤形成的能力[2]。肝CSCs能够通过一些表面标记物被富集，如CD13、CD24、CD90和CD133等[3-7]，且CD24能通过STAT3介导的Nanog调控作用促进肝CSCs的自我更新和致肿瘤性[4]。已有的研究[8]证明，转录因子Nanog是肝CSCs的一个独特标记物，且在肝CSCs自我更新过程中发挥重要的调控作用。然而，肝CSCs如何维持自我更新能力仍然未知。去乙酰化酶1(sirtuins，SIRT1)能催化脱去组蛋白和非组蛋白的乙酰基[9]。癌症中，SIRT1在恶性组织和细胞中持续上调表达，且已经证明其与癌症的快速进展和预后不良有关[10]。SIRT1在维持胚胎干细胞和造血干细胞自我更新过程中发挥重要作用，尤其是在应激条件下[11]。然而，SIRT1在肝CSCs更新中的作用仍然未知。本研究探讨了SIRT1在肝CSCs更新中的作用及相关分子机制，以期为肝癌的临床治疗提供思路。

1 材料与方法

1.1材料与仪器HEK-293FT细胞、稳定表达Nanog-GFP的Huh7细胞株由本实验室保存。恒温CO2培养(美国Thermo Fisher)、多功能酶标仪(美国BioTek公司)、流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2主要试剂DMEM/F12 培养基、DMEM培养基均购自美国Gibco公司；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，以色列BI公司)；胰蛋白酶、Polybrene均购自美国Sigma公司；细胞因子bFGF、EGF、HGF均购自美国Pepro Tech公司；B27(美国Gibco公司)；谷氨酰胺(上海生工)；青霉素、链霉素(美国Sigma公司)。完全培养基的成分如下：DMEM、质量浓度为100 g/L的胎牛血清、青霉素与链霉素(100 U/ml、100 μg/ml)；成球培养基: DMEM/F12培养基、bFGF(20 ng/ml)、EGF(20 ng/ml)、HGF(10 ng/ml)、B27(50×)、谷氨酰胺(2 mmol/L)、青霉素与链霉素(100 U/ml、100 μg/ml)。兔抗人SIRT1、鼠抗人SOX2抗体(美国SantaCruz公司)；鼠抗人c-Myc抗体、兔抗人Nanog抗体(美国Abcam公司)；鼠抗人α-tubulin抗体(美国Sigma公司)；HRP标记的羊抗兔/鼠IgG(美国Abcam公司)。质粒转染试剂盒X-TremeGENE HP DNA Transfection Reagent(德国Roche)，DAPI(上海碧云天生物技术研究所)，Transwell 细胞小室(德国 Merck Millipore 公司)。

1.3肝CSCs的获取将本实验室保存的稳定感染Lv-PNanog-GFP慢病毒的Huh7细胞扩大培养后，胰酶消化细胞，培养基终止消化，离心收集细胞，PBS重悬细胞，细胞悬液过200目筛网后，流式细胞仪分选GFP阳性细胞，这群Huh7-Nanogpos细胞为肝CSCs。细胞株培养于质量浓度为100 g/L FBS的DMEM培养基中，于37 ℃，体积分数为5%的CO2饱和湿度下进行培养。稳定传代2～3代后，取对数生长期细胞进行后续实验。

1.4肝CSCs转染肝CSCs接种于6孔板中，采用质量浓度为100 g/L FBS+DMEM培养基培养至细胞汇合度达到60%后，实验组每孔加入100 nmol/L SIRT1特异性siRNA及5 μl LipofectamineTM2000；对照组每孔加入100 nmol/L阴性对照(NC-siRNA)及5 μl的LipofectamineTM2000。对于逆转实验，转染SIRT1特异性siRNA后24 h，再转染过表达SOX2质粒，每孔加入3 μg质粒及2 μl LipofectamineTM2000。每孔加入无血清DMEM培养基至终体积2 ml，置于37 ℃，体积分数为5%的CO2、饱和湿度培养箱中培养6 h，然后更换完全培养基继续培养。

1.5球体形成检测Huh7-Nanogpos细胞转染NC-siRNA或siSIRT1后48 h，两组细胞均用常规方法收集：胰酶消化细胞，质量浓度为100 g/L FBS+DMEM终止消化，离心，PBS重悬细胞，然后对照组和实验组细胞均用流式细胞仪以30个/孔的密度接种于低黏附96孔细胞培养板中，每组8个重复孔，培养板孔中预先加入100 μl成球培养基，37 ℃，体积分数为5%的CO2培养箱培养。3 d后补充1次成球培养基150 μl，继续培养7 d后，光学显微镜下计数不同处理组成球个数,并计算球体形成率。成球率(%)=(平均细胞球数/接种细胞数)×100%。

1.6克隆形成能力检测过表达SIRT1的Huh7-Nanogpos及空载体对照细胞均用常规方法收集：胰酶消化细胞，培养基终止消化，离心，PBS重悬细胞，然后对照组和实验组细胞均用流式细胞仪以50个/孔的密度接种于24孔细胞培养板中，每组12个重复孔，培养板孔中预先加入500 μl 质量浓度为100 g/L FBS+DMEM，于37 ℃，体积分数为5%的CO2培养箱培养。每隔3 d更换1次新鲜培养基，培养12 d后，弃掉培养基，PBS洗2遍，使用质量浓度为40 g/L的多聚甲醛固定30 min后吸去，质量浓度为4 g/L 结晶紫溶液染色5 min后吸去，用去离子水洗弃残余的结晶紫溶液，自然风干，计数不同处理组细胞数大于50个的克隆并计算克隆形成率。克隆形成率(%)=(平均克隆形成数/接种细胞数)×100%。

1.7Westernblotting检测SIRT1、SOX2、c-Myc和Nanog表达胰酶消化并收集经特定处理的细胞，用含有蛋白酶抑制剂的NP40裂解液重悬裂解细胞，冰上裂解30 min，15 000×g离心10 min，收集细胞裂解上清用于跑SDS-PAGE。然后将总蛋白转移至PVDF膜上，膜经质量浓度为50 g/L 脱脂奶粉室温封闭1 h后，孵育一抗。一抗稀释比例如下：抗SIRT1抗体，1∶1 000、抗SOX2抗体，1∶1 000、抗c-Myc抗体，1∶500、抗Nanog抗体，1∶1 000、抗α-tubulin抗体：1∶5 000，4 ℃孵育过夜。HRP标记的羊抗鼠/兔二抗(1∶5 000)，室温孵育2 h。α-tubulin为上样的内参蛋白。目的蛋白用ECL发光液进行显色。使用GeneTools图像分析系统对目的蛋白的灰度值进行分析。

1.8BALB/c裸鼠成瘤实验1×106个NC-siRNA或siSIRT1转染的肝脏CSCs通过皮下注射的方式注射入BALB/c皮下组织，每组5只裸鼠。分为NC-siRNA组、siSIRT1组、非肝脏CSCs组和非肝脏CSCs+SIRT1过表达组。接种后每天观察裸鼠肿瘤生长情况，并且每隔5 d测量一次肿瘤体积。5周后，将所有实验裸鼠颈椎脱臼处死，去除瘤体，测量肿瘤的长径和短径。皮下肿瘤体积(TV)计算公式:TV=0.5×A×B2(A、B分别代表瘤体长径和短径)，根据测量结果计算肿瘤体积，分析不同SIRT1表达情况对肝脏CSCs致肿瘤性的影响。

2 结果

2.1SIRT1在在肝CSCs中过表达Western blotting检测结果表明，SIRT1在肝脏CSCs表达显著高于非-CSCs(见图1A，P<0.001)。而免疫荧光染色结果也证实，SIRT1在肝CSCs中高表达(见图1B)。

图1 肝脏CSCs中SIRT1表达情况 A: Western blotting检测结果；B: 免疫荧光染色检测(200×)Fig 1 Expression of SIRT1 in liver CSCs A:detection results of Western blotting; B:detection of immunofluorescense assay(200×)

2.2SIRT1余肝脏CSCs自我更新和致肿瘤性有关结果表明，敲低SIRT1表达能显著抑制肝脏CSCs克隆形成和球体形成能力(见图2A和2C)。BALB/c裸鼠成瘤体内实验结果表明，沉默SIRT1表达能显著抑制皮下肿瘤模型小鼠体内肿瘤生长(见图2B)。

2.3过表达外源性SIRT1能恢复肝脏非-CSCs的自我更新能力Western blotting检测结果表明，肝脏非-CSCs中SIRT1表达量显著升高(见图3A，P<0.001)，且过表达SIRT1提高了肝脏非-CSCs的克隆形成能力(见图3B)。肿瘤启动实验结果表明，实验小鼠移植肝脏非-CSCs后，体内形成小型肿瘤，而移植过表达SIRT1的肝脏非-CSCs的小鼠体内肿瘤体积明显更大(见图3C)。

注：**P<0.01; *** P<0.001。

注：**P<0.01; *** P<0.001。

2.4敲低或抑制SIRT1活性降低肝CSCs的干性特征结果表明，敲低SIRT1表达的同时也抑制了SOX2表达水平(见图4A)。而SIRT1特异性抑制剂TV6抑制SIRT1表达的同时也抑制了SOX2表达(见图4B)。SIRT1可能直接调控SOX2表达从而调控肝CSCs的自我更新能力。

注：*P<0.05; ** P<0.01；*** P<0.0010。

2.5SIRT1通过SOX2调控肝CSCs的自我更新SIRT1的蛋白表达与SOX2呈正相关(见图5A)。过表达外源性SOX2能部分逆转敲低SIRT1表达所导致的肝CSCs克隆形成下降(见图5B)。肿瘤启动实验结果表明，过表达外源性SOX2能部分逆转敲低SIRT1表达所导致的肝CSCs致肿瘤性下降(见图5B)。

注：**P<0.01; *** P<0.001。

3 讨论

尽管研究已经证明SIRT1是一种肿瘤抑制因子，但也有一些研究表明SIRT1能够促进肿瘤进展[12]。对于HCC，SIRT1在肿瘤组织中过度表达，且其在肿瘤细胞生长和致肿瘤性方面发挥重要作用[13]，表明SIRT1在HCC中是一种致癌基因。本研究进一步证实，SIRT1在干样特性的HCC细胞亚群中过度表达，且其对于该类型细胞的自我更新和致肿瘤性的维持是必需的。

以前的报道认为，SIRT1能通过消除活性氧自由基及抑制p53表达而抑制造血干细胞分化，且有助于干细胞池的维持[14-15]。且SIRT1通过p53脱乙酰作用增强iPSC生成[16]。这些研究表明，SIRT1催化的p53脱乙酰作用有助于干细胞的生物特性的形成。由于p53突变和失调表达主要在癌症和HCC细胞中发生，SIRT1似乎不太可能通过调控p53表达而调控肝CSCs的自我更新和致肿瘤性。因此，本研究集中探讨了SIRT1的功能对多能性转录因子表达的影响。本研究结果表明，SIRT1能调控SOX2表达，且进一步的研究证实，SOX2是SIRT1-介导的肝CSCs自我更新和致肿瘤性中的主要调控因子。

SOX2是SOX基因家族的一员，其编码的SOX2蛋白能结合特异性的DNA靶序列，引起DNA发生一定程度的弯曲，从而调控靶基因的转录[17]。有研究表明，生殖细胞肿瘤中SOX2表达异常升高[18]；BILD等[19]的研究发现，卵巢癌患者生存时间不足5年的患者其组织中SOX2表达水平显著高于生存时间超过5年的患者；SANADA等[20]研究发现，随着胰腺癌的进展，胰腺癌组织中SOX2表达量逐渐增加。由此可见，SOX2基因的表达与癌症的发生、发展密切相关。本研究发现，SIRT1能通过调控SOX2表达而调控肝CSCs的自我更新和致肿瘤性。这可能揭示,SIRT1调控肝CSCs更新和致肿瘤性的一种可能的机制，具体的分子机制还需要进一步深入研究。

总之，当前的研究证明,SIRT1的高水平表达对于维持人肝CSCs的未分化状态是必需的。这种效应是通过SIRT1靶向其下游分子SOX2发挥的。然而，作为一种转录因子，SOX2下游的靶向分子仍不清楚，这是我们下一步的研究重点。但本研究仍为SIRT1作为肝癌治疗的新型靶位点提供了初步的理论依据。

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