利用双酶法定向合成右旋糖酐现状研究

蓝尉冰，王帅静，张义平，陈华磊，于钥，黄双霞，陈山,3*

(1.广西大学， 南宁 530004；2.糖业及综合利用教育部工程研究中心，南宁 530004；3.广西蔗糖产业协同创新中心，南宁 530004；4.钦州学院，广西 钦州 535011)

右旋糖酐(Dextran)是蔗糖由肠膜明串珠菌发酵得到的产品，在化工、医学、食品和化妆品等工业领域均有广阔的应用，如低热右旋糖酐已使用在饮料、调味料等产品的生产。右旋糖酐可通过传统发酵法和酶法这两种方法合成。目前，右旋糖酐主要经发酵法生产获得，酶的生成和酶催化生成右旋糖酐同步进行，这个过程具有不可控制性，产量和品质不稳定。且后期需化学试剂酸进行降解后通过乙醇分级沉淀处理，所得产物分子量分散度广，活性基团易被破坏，带入有害成分，成本较高。酶法制备将酶的生成和酶诱导合成分开在不同的反应器中进行，所得产物纯度高，分子量分布均匀，酒精使用量少，降低了成本。用酶法获得右旋糖酐与发酵法相比，其可连续化生产、杂质含量低、产品分子量可调控等优点，具有较为广阔的应用前景。但由于单酶合成所得的右旋糖酐分子量不易于控制，故本文以制备右旋糖酐为出发点，综述了双酶法定向合成右旋糖酐，为右旋糖酐的生产提供了新的理论支持。

1 双酶法合成右旋糖酐的机理

右旋糖酐的酶法合成包括酶的制备及酶合成右旋糖酐两部分，且此两部分分别独立进行。双酶法是首先利用葡聚糖蔗糖合成酶合成相对分子量较大的右旋糖酐后加入分解酶分解得对应目标右旋糖酐。其机理主要是右旋糖酐蔗糖合成酶分子由1250～1600个差异的氨基酸构成，其蛋白质分子具由图1所示的4个区域，其中A和B分别为信号肽段和可变区，C和D则是具有结合与分离蔗糖的N-末端催化区及具右旋糖酐链绑定的C-末端右旋糖酐联结区。C是核心区，酶与蔗糖以共价键的形式结合且将蔗糖分解变为D-glucosyl-Enzyme，此酶形成很关键；D区域联结葡萄糖基，使得右旋糖酐链增长[1]。

图1 右旋糖酐蔗糖酶的编码基因图Fig.1 The schematic structure of dextransucrase encoding genes

在酶催化的条件下，反应可朝4种朝向进行：(a)D-葡萄糖基的迁移，是D-葡萄糖基局部要么被迁移到受体单糖要么到低聚糖里[2]；(b)蔗糖水解，是D-葡萄糖基部分被迁移到水中[3]；(c)D-葡萄糖基支链的形成或右旋糖酐链的转移，一种可能是由部分D-葡萄糖基被迁移到右旋糖酐链，另一种可能是部分D-葡萄糖基随右旋糖酐链迁到另一条糖酐链中；(d)聚合反应终止，即右旋糖酐的释放。由两种可能：一种是右旋糖酐链迁移到水中，另一种是跟其他受体结合，这些受体包括蔗糖、D-果糖、D-葡萄糖、麦芽糖等。但是，右旋糖酐蔗糖合成酶的主要作用是通过催化作用合成右旋糖酐，催化原理见图2。

图2 右旋糖酐蔗糖酶合成右旋糖酐机理示意图Fig.2 Schematic diagram of dextran synthesizing mechanism

注：○为葡萄糖，△为果糖，○-△为蔗糖，X1，X2为酶活性位点的亲和团，○-○为由α-1，6糖苷键链接的葡萄糖基团。

右旋糖酐酶(Dextranase，酶的系统分类号为E.C.3.2.1.11)是一种分解酶，可随机地切右旋糖酐中的α(1→6)糖苷键。右旋糖酐酶主要属于糖苷水解酶家族GH 家族里，包括GH49，GH13，GH27，GH15，GH66家族，主要分有外切型和内切型两种。其中，GH13和GH15家族(如球形节杆菌右旋糖酐酶)属于外切型，具有(α/α)6三维结构。GH49和GH66家族(如口腔链球菌右旋糖酐酶)属于内切型，具有一种β螺旋结构；GH27家族是一种α-1,6糖苷键被通过从非还原端降解放出异麦芽糖基元的异头碳保留机制，是特殊家族。Larsson A M等[7]报道了微生物产右旋糖酐酶的晶体构造并研究其催化作用机理，表明黄青霉产右旋糖酐酶主要有一个右手平行的β 螺旋结构与 N末端的 β 夹层两个结构域，通过深入探索发现该酶的化学反应有异头碳反转现象，揭示了右旋糖酐酶存在一个单一的置换机理[4]。

2 双酶法合成右旋糖酐的研究现状

目前，也有通过酶法合成葡聚糖的报道，但仅限于单酶法较多。张洪斌等[5]通过研究发酵工艺获得不同分子量的葡聚糖发酵工艺；王雅洁等[6]对重组大肠杆菌右旋糖酐蔗糖酶纯化且做了酶学性质相关研究。表明蔗糖既是该酶作用底物也是诱导剂，利用右旋糖酐蔗糖酶催化蔗糖所得葡聚糖粘性大，与酶缠绕难于分离。Berensmeier S等[7]对可应用于流化床的固定化葡聚糖蔗糖酶进行了研究。Mohan R T J等[8]以蔗糖为底物，利用葡聚糖蔗糖酶制备葡聚糖，得到其最适条件为35 ℃，pH值5.4和5.0%(W/V)的蔗糖浓度。关于双酶法合成右旋糖酐报道并不多见。姚日生等[9]用海藻酸盐巩固葡聚糖蔗糖酶提高该酶酶活并生产葡聚糖，通过加入右旋糖酐酶降解高分子量产物，并对酶的反应条件进行的相关研究。有学者通过不同色谱法及循环超滤膜等方法研究双酶作用，如Goulas A K等[10]对游离的DS与DN构建的体系进行详细研究，得出双酶可调节右旋葡聚糖分子量大小，且低分子量的右旋葡聚糖的量会随底物浓度及右旋糖酐酶量的增大而增加，但并未对合成规律和机制进行研究。2004年，Kubik C等学者[11]研究了右旋糖酐蔗糖酶酶活提高方法，运用已固定化了的右旋糖酐蔗糖酶协同未固定化的右旋糖酐酶制备多糖，结果表明经戊二醛、海藻酸钠固定化后可提高蔗糖利用率，但经过多次利用，其转化率降低。甘薇苇[12]用右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶构建双酶体系制备右旋葡聚糖，得出蔗糖溶液双酶催化反应3 h，体系中果糖浓度已经超过蔗糖，果糖峰面积占总体积的10.78%，抑制右旋葡聚糖生成。2008年，Erhardt F A等[13]研究共固定化双酶体系合成低聚糖，发现已被海藻酸钙固定化的右旋糖酐蔗糖酶共固定右旋糖酐酶后可以利用蔗糖为底物催化形成低分子量多糖。次年，具有右旋糖酐蔗糖酶与右旋糖酐酶共同活力的融合酶诞生，其是由国外学者Kim Y M等[14]将来自不同菌株产的右旋糖酐蔗糖酶及右旋糖酐酶基因片段以大肠杆菌为载体表达，此酶可利用蔗糖为底物聚合得到低聚糖，且相比于未融合的混合酶液，同等活力下，融合酶获得的低聚糖产量更多，研究并指出可通过调节底物浓度调控低聚糖分子量分布，这项研究使双酶合成右旋糖酐得到更进一步了解。而Oelcer等[15]将DSase酶与Dase酶共同固定化于海藻酸钙凝胶中，将共固定化小球作用于底物蔗糖溶液，使得DSase酶催化蔗糖产生的右旋糖酐作为Dase酶的底物被降解，最后生成低聚糖。采用这种双酶共同固定化方法，控制酶的配比及固体化小球与底物接触反应的时间，有可能得到目标分子量的右旋糖酐产物。

3 双酶法合成右旋糖酐产物检测

目前对于酶法合成右旋糖酐，基于分子量不同的右旋糖酐其用途各不相同，故大部分研究属于右旋糖酐分子量调节研究，故对右旋糖酐产物分子量检测方法至关重要。多糖分子量的检测技术有多种，包括端基分析法、渗透压法、光散射法、粘度法、体积排阻色谱法等。其中，端基分析法、渗透压法一般较适用于测定多糖物质的数均分子量，而光散射法较适用于测定多糖物质的重均分子量。 体积排阻色谱法(SEC)是各种色谱分离方法中最简单的，其利用多孔凝胶固定相依据不同分子大小差异从而达到分离的方法。根据所用凝胶的性质，可以分为使用水溶液的凝胶过滤色谱和使用有机溶剂的凝胶渗透色谱(gel酶、多糖等生物分子)。根据分子筛的原理，样品组分在通过凝胶柱时，大分子物质被凝胶孔洞阻止而最先被流动相淋洗出来；中分子物质能够进入固定相凝胶中的一些适合其大小的孔洞，在分离柱中滞留一定时间，较慢被流动相淋洗出来；而小分子物质能够进入凝胶中更微小的孔洞，在柱子中受到更长时间的滞留，而最后被流动相淋洗出来。采用体积排阻色谱法，可通过软件直接得到样品的数均分子量、D值、重均分子量等信息。

4 右旋糖酐应用

右旋糖酐是由α-D-葡萄糖聚合而成的一种同多糖，因其具有很强的正旋光性，故又称其为“右旋糖酐”。右旋糖酐是具有多种用途的多糖，其作用备受学者青睐。分子量分布较集中的低分子量右旋糖酐在临床上是一种治疗药物，它常作为血浆扩容剂或血浆替代物，能够提高失血过多患者的血容量，用于出血性及创伤性等休克事件的解决，还能改善血液微循环，预防或消除血管内红细胞聚集和血栓的形成等[16]，这也是推动右旋糖酐商品化最重要的一个因素。分子量约在1～10万的右旋糖酐药用价值巨大，其中Dex-20，Dex-40 以及Dex-70被中国药典收录[17]。由右旋糖酐诞生的其衍生物有广泛的医学用途，右旋糖酐铁和右旋糖酐锌能够治疗贫血症和锌缺乏症，右旋糖酐硫酸酯具备近似于肝素的抗凝血功效，右旋糖酐因其具有一定的胶体特性和生物相溶性，还能够作为药物辅助材料或者是药物输送载体[18]。将纯化后的大分子右旋糖酐与环氧氯丙烷反应，再导入丙三醇侧链，在右旋糖酐链间形成交联链，所制得的交联葡聚糖[19]具有广阔的应用价值。它在水中能溶胀却不能溶解，交联度越高，凝胶孔径越小，常用于制备凝胶渗透色谱柱用来分离蛋白质、多糖等大分子物质，著名的商品化的交联葡聚糖凝胶柱有Phamacia Fine Chemicals生产的Sephadex和Sephacryl。在食品工业，右旋糖酐可作为增稠剂被用在果酱、冰淇淋等食品，以提高食品的口感与风味；低热葡聚糖已被用于调味料、果酱的生产等[20]。

5 总结与展望

多糖是典型生物大分子，其生物功能逐渐引起学术界的重视。右旋糖酐以其特有性质被广泛应用于医学、化工、食品等行业，是受关注的糖类之一。其传统工艺是经微生物发酵所得，分子量排布较广，尤其中小分子量含量少，杂质较多，粘度大，后期处理过程繁琐。酶法合成多糖被认为是安全且有效的合成途径，且酶法在温和条件下通过向蔗糖底物添加右旋糖酐蔗糖酶就可合成右旋糖酐。但由于单酶合成取得的右旋糖酐分子量不易于控制。而双酶体系因其可使底物转化率高、促进合成、反应快、产物分子量可调控等而成为制备多糖的热门方法。其主要机理是在没有其他受体的环境中，蔗糖底物被右旋糖酐蔗糖酶先催化生成D-葡萄糖基和果糖基，后D-葡萄糖基要么被迁移到水分子要么是右旋糖酐残基C3/C6位置，水解蔗糖或聚合成右旋糖酐糖链。随着反应的进行，右旋糖酐慢慢增长形成大分子。通过添加右旋糖酐酶双酶法可降解大分子右旋糖酐，获得适合食品、药品等广泛价值的小分子量右旋糖酐。双酶法在开发大幅减少或不使用有害化学试剂直接快速高效获得药用右旋糖酐的新技术起到协助作用。

[1]Monchois V,Willemot R M,Monsan P.Glucansucrases:mechanism of action and structure-function relationships[J].FEMS Microbiology Reviews,1999,23(2):131-151.

[2]Robyt J F,Eklund S H.Relative,quantitative effects of acceptors in the reation ofLeuconostocmesenteroidesB-512F dextransucrase[J].Carbohydrate Research,1983,121:279-286.

[3]Luzio G A,Mayer R M.The hydrolysis of sucrose by dextransucrase[J].Carbohydrate Research,1983,111(2):311-318.

[4]Larsson A M,Andersson R,Stahlberg J,et al.Dextranase fromPenicilliumminioluteum: reaction course,crystal structure,and product complex[J].Structure,2003,11(9):1111-1121.

[5]张洪斌,姚日生,朱慧霞,等.发酵法生产右旋糖酐的工艺研究[J].合肥工业大学学报(自然科学版),2004,27(7):783-787.

[6]王雅洁，张洪斌，胡雪芹，等.重组大肠杆菌右旋糖酐蔗糖酶的纯化及其性质[J].微生物学报，2008，48(9)：1266-1269.

[7]Berensmeier S,Ergezinger M,Bohnet M,et al.Design of immobilised dextransucrase for fluidised bed application[J].Journal of Biotechnology,2004,114(3):255-267.

[8]Mohan R T J,Goyal A.Purification,optimization of assay,and stability studies of dextransucrase isolated fromWeissellacibariaJAG8[J].Preparative Biochemistry and Biotechnology,2013,43(4):329-341.

[9]姚日生,董明辉,朱慧霞.酶法合成右旋糖酐相对分子质量的控制[J].精细化工,2007,24(10):964-967.

[10]Goulas A K,Fisher D A,Grimble G K,et al.Synthesis of isomaltooligosaccharides and oligodextrans by the combined use of dextransucrase and dextranase[J].Enzyme and Microbial Technology,2004,35(4):327-338.

[11]Kubik C,Sikora B,Bielecki S.Immobilization of dextransucrase and its use with soluble dextranase for glucooligosaccharides synthesis[J].Enzyme and Microbial Technology,2004,34(6):555-560.

[12]甘微苇.右旋糖酐蔗糖酶与右旋糖酐酶协同催化制备低聚右旋糖酐与低聚糖的研究[D].合肥：合肥工业大学,2014.

[13]Erhardt F A,Kugler J,Chakravarthula R R,et al.Co-immobilization of dextransucrase and dextranase for the facilitated synthesis of isomalto-oligosaccharides: preparation,characterization and modeling[J].Biotechnology and Bioengineering,2008,100(4):673-683.

[14]Kim Y M,Seo M Y,Kang H K,et al.Construction of a fusion enzyme of dextransucrase and dextranase: application for one-step synthesis of isomalto-oligosaccharides[J].Enzyme and Microbial Technology,2009,44(3):159-164.

[15]Oelcer Z,Tanriseven A.Co-immobilization of dextransucrase and dextranase in alginate[J].Process Biochemistry (Amsterdam,Netherlands),2010,45(10):1645-1651.

[16]Tam S C,Blumenstein J,Wong J T.Soluble dextran-hemoglobin complex as a potential blood substitute[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1976,73(6):2128-2131.

[17]国家药典委员会.中华人民共和国药典(2010版，二部)[M].北京：中国医药科技出版社，2010：111-117.

[18]Krol A,Dewhirst M W,Yuan F.Effects of cell damage and glycosaminoglycan degradation on available extravascular space of different dextrans in a rat fibrosarcoma[J].International Journal of Hyperthermia,2003,19(2):154-164.

[19]Tomme S R,Nostrum C F,Smedt S C,et al.Degradation behavior of dextran hydrogels composed of positively and negatively charged microspheres[J].Biomaterials,2006,27(22):4141-4148.

[20]宋少云,廖威.葡聚糖的研究进展[J].中山大学学报(自然科学版),2005,44(s2):229-232.