鹿结核病诊断技术研究进展

刘艳环，谷晨晨，李海涛，朱言柱，常彤，王玉芳，苗利光※，庄宝策

（1.中国农业科学院特产研究所，长春 130112；2.吉林省永吉县一拉溪镇畜牧兽医站，吉林 永吉 132213）

结核病（Tuberculosis，TB）是在全球范围内广泛传播的一种慢性、消耗性人畜共患传染病。鹿结核病主要由牛型结核分枝杆菌和人型结核分枝杆菌引起，不仅给养鹿业造成严重损失，同时也是人结核病的主要传染源。结核病的历史可以追溯到距今约7000年以前，而该病真正被文字所记载则是在公元前460～公元前370年，由古希腊医学家所述，并将该病界定为传染性疾病。

结核病的发现和文字记载虽然很早，但是人类一直没有给予其应有的重视，并因此付出了惨痛的代价。18世纪的欧洲，因为结核病的盛行，欧洲人的平均寿命仅有35岁；发展到19世纪，由于疾病的大规模流行，在接近100年的时间内，成年人的患病死亡率竟高达97%。

1882年，对结核病的研究取得了里程碑式突破。德国科学家Robert Coch发明并应用了抗酸染色法，成功鉴定出了结核病的病原结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis），此举标志着对结核病的研究进入了新纪元[1]。

在Coch研究的基础上，法国科学家Calmette和Guerin耗时13年，经过230余次试验，将牛结核分枝杆菌毒性弱化趋近于零，成功研制出用于预防结核病的疫苗，并于1921年首次临床试验。1928年，法国国家科学大会正式将该疫苗命名为卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin，BCG），结核病开始得到遏制。而1943年治疗药物链霉素的出现，则标志着结核病终于不再是不治之症。

结核病在全球范围内分布很广，是人类史上持续时间最长的疾病之一，也是单一病原致死人数最多的疾病。结核病感染率、死亡率、耐药率都很高，是可通过多途径传染的人畜共患病[2]。

结核病可危害人和多种动物，动物因其种类多样性和个体之间的差异而对该病呈现或高或低的易感性[3]。在家畜中，牛的易感性最高，尤其是奶牛。家禽和猪的易感性也较强，羊则易感性较低，极少患病。在野生动物中，鹿最易受到感染，相比于其他动物表现出较强的易感性。

开放型结核病患者和患病畜禽为主要传染源，其痰液、乳汁、粪尿和生殖道分泌物中都可携带病菌。该病典型的局部病变是在机体大多数组织和器官形成结核结节、干酪样坏死或钙化结节[4]。

该病感染途径主要是呼吸道和消化道感染，病菌随患病个体的喷嚏和咳嗽排出体外，健康的人、畜吸入外界漂浮的病菌即可被感染[5]。

我国的人畜结核病虽然被有效控制，但是近年来由于耐药结核病的异军突起，导致现有治疗药物的效果大幅度减退，结核病疫情又呈现增长的趋势。2016年，全球有超过1 000万的新病例出现，给世界各国带来了巨大的经济损失，因此国际组织和我国都将结核病作为重点防治的疾病之一[6]。

鹿结核是结核病的主要传染源之一，建立有效的鹿结核病诊断方法意义重大，但是，目前我国针对鹿结核病没有规范化的诊断标准，主要参照牛结核病的诊断方法进行诊断。现将鹿结核病的诊断研究进展情况作一综述。

1 临床诊断

鹿结核病一般为慢性经过，病初症状不明显，随着病情的发展，症状才逐渐显现，主要表现为食欲不振、食量下降、精神萎靡、进行性消瘦等临床症状。根据病鹿呈现的进行性消瘦、被毛粗糙、咳嗽及体表不同部位的肿块等症状，可初步诊断为鹿结核病。

2 病理解剖学诊断

病理学检查是一种以诊断学和微生物学为基础的检验方法，相较于其他方法，使用更加普遍并且可靠。由于鹿结核病与牛结核病是由同种病原引起，因此两种疾病的病理变化极为相似。

鹿结核病主要病变集中在肺纵隔、体表和肠系膜淋巴结，病变部位出现粟粒至豌豆大小的结核结节。结节初期质地坚硬，后期柔软，有生面团样触感，切开后有黄白色脓液流出，无特殊异味。也有个别病例会在胸腔和肠腔的浆膜上出现结核结节，多数为灰黄色、黄豆大小且呈半透明的珍珠状或葡萄状，因此又称为“珍珠样”结节，该病灶则称为“珍珠肿”[6～10]。

3 病原学诊断

病原学检查主要包括涂片镜检和病原分离鉴定。

涂片镜检对于开放期病鹿的诊断十分有效。对病变组织、尿液样本、粪便样本处理后进行涂片[11]，抗酸染色后呈单独或成对存在的红色平直或稍弯曲的杆菌。在纯培养物中菌体则呈细长或球杆状等，形态多样，无芽孢，无鞭毛，是否具有荚膜有待进一步考证。

有研究证实，改良罗氏培养基（LJ）和丙酮培养基（SP）对病原菌分离率较高，被认定为最适合用于结核病病原菌的分离和鉴定的培养基[12]。

4 结核菌素皮内诊断

目前，世界卫生组织（WHO）推荐使用结核菌素皮下试验检测鹿结核病，欧洲的诸多国家通过该方法有效控制并消灭了结核菌。该方法通过对动物机体进行皮内接种结核菌纯化蛋白衍生物（PPD）后观察接种部位的厚度与硬度，根据标准来衡量肿胀情况，即可确诊动物是否患有结核病[13，14]。但该方法灵敏度较差，个体的差异性易导致出现不同的试验反应结果；非特异性较强，易受到非致病性分枝杆菌感染的影响，虽然结核菌素试验阳性，但多数鹿并无病变或无法分离出致病性结核杆菌，疑似假阳性。因此，应用该方法无法判定鹿是否感染结核病。该试验阳性结果仅能判断机体曾感染过结核分枝杆菌，无法区分疫苗接种和自然感染[15]。鹿作为经济动物，多数地区采取检疫-捕杀的策略，盲目地捕杀造成了一定程度上的经济损失。

5 血清学诊断

血清学诊断目前是一种较为可靠的检测方法

5.1 酶联免疫吸附检测

近些年，随着酶联免疫吸附（ELISA）诊断技术的不断完善，已广泛被应用于各种病原的检测。1971年，首次报道建立酶联免疫吸附试验检测该疾病的方法，以其具有简便快速、敏感性高、易于标准化等优点而快速发展起来[16，17]。1976年，该方法正式应用于结核病患畜的血清检测。目前，ELISA法检测鹿结核病已得到各个国家的认可，并利用该方法有效控制了结核病的传播，避免了以往所采取的通过对野生动物大量捕杀这一防控措施。该方法的原理为通过酶标记抗原或抗体来检测对应抗体或抗原，根据显色的结果可以判定阴性、阳性[18]。该方法敏感性较高、特异性较强，在鹿结核病的检测领域有较好的发展及应用前景[19]。ELISA法作为传统的检测方法的补充试验，在机体反应的识别方面扮演着非常重要的角色[20]。

但是，结核分枝杆菌的抗原性相对较弱，并且种属间存在相同的抗原决定簇，所以，ELISA检测手段在结核病诊断中并未取得较为实质性的进展，结核病与体液免疫的相关性需要更加深入地探究和论述[21]。

5.2 胶体金诊断法

1971年，Faulk和Taytor在免疫化学领域引入胶体金的概念，此后胶体金诊断法作为一种新的免疫学方法蓬勃发展，至今已广泛应用于各医学相关领域。

相比于临床医学，在动物医学的临床诊断中，该方法发展较晚，投入到实际应用中的试剂盒较少。免疫胶体金技术简单、快速、灵敏、特异，可肉眼观察检测结果，检测结果易于保存，目前，已开始广泛应用于动物疾病的诊断。

斑点免疫金渗滤测定法（Dot immunogold filtration assay，DIG.FA）是免疫胶体金技术中比较具有代表性的一种方法[22]。但是，该方法有假阴性和假阳性，重复性及灵敏程度也不尽如人意，检测的范围无法满足发展需求[23，24]。

5.3 IFN-诊断法

5.4 免疫印迹法

免疫印迹法（Immunoblottingtest，IBT）又称为酶联免疫电转移印斑法（Enzyme linked immunoelectrotransfer blot，EITB），是将蛋白质转移到固相支持物上，然后利用该蛋白对应一抗以及酶标记的二抗进行反应，并通过底物显色检测的方法。

目前，该技术发展较为成熟，操作完善、反应特异性强，可适合大规模检测。该方法已经开始应用于常见的疫病病原检测[28，29]。免疫印迹法缺陷在于其无法精确定量，存在上样误差，并且会受到信号杂带的干扰[30]。

6 分子生物学诊断

6.1 聚合酶链式反应检测法

在分子生物学检测技术中，聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）是检测鹿结核病的最常用的方法，无论是在医学还是兽医学领域，该方法都具有巨大的研究价值[31]。

PCR技术首次于1985年由karymullis发明。Young等应用此方法成功建立了有关结核杆菌基因文库，并成功分离出了结核杆菌相关蛋白抗原编码基因，并予以鉴定。1989年，PCR技术首次应用于结核病的诊断，并通过研究证实，其特异性高于ELISA[32～34]。

6.2 DNA指纹技术

DNA指纹是指具有完全个体特异的DNA多态性，其个体识别能力足以与手指指纹相媲美，可广泛应用于个体识别和亲子鉴定等方面。其原理在于DNA指纹的图像呈条纹状，酷似条形码，且图纹具有唯一性，故称之为“DNA指纹”[35]。

DNA指纹技术常用于菌种的鉴定，找出致病病原，确定流行源头；还可以用来辨别感染途径，以分辨机体是感染源还是被侵袭体。当前主要应用的有DRE-PCR、Spoli-gotyping、IS6110-PCR以及PCRRELP 等[36～38]。

6.3 生物芯片技术

1996年，美国Affymetrix公司成功研制出世界上首批生物芯片，并制作出芯片系统，欧洲和日本紧随其后，我国对生物芯片的研究则刚刚起步，从2016起开始快速发展[39，40]。

生物芯片（Biochip）技术是通过缩微技术实现包括抗原在内的生物学组分的检测，该技术可用于疾病临床诊断，目前，处于分子生物学领域的最前沿[41]。

6.4 核酸探针法

核酸探针杂交技术是指利用核酸变性和复性的原理，使得带有标记物的已知序列的核酸片段，和与其互补的核酸序列杂交形成双链，因而能用于样品中特定基因序列的检测[42]。

核酸探针技术具有专一性强、灵敏度高、快速、准确等特点，这些优势使其在生物大分子研究、药物分析、司法鉴定、临床疾病诊断和治疗等方面都发挥出巨大作用。

综上所述，目前，尚无有效方法可以在早期诊断出自然感染鹿，并排除BCG免疫的干扰。现我国用于鹿结核病预防的疫苗为BCG。但是，BCG接种后PPD皮试结果易呈假阳性，应用于动物的免疫效果并不理想。因此，国外多数国家并未使用BCG，而是主要以“检疫-捕杀”的政策来控制结核病在鹿中的传播，导致了大量野生动物遭到捕杀，由此带来的损失难以估量。如何实现对鹿结核病的早期诊断仍是一个重要课题。