血管性认知功能障碍动物模型研究进展❋

李 欧，沙中玮，吴 双，李志敏，徐 建

(上海中医药大学附属上海市中医医院,上海 200071)

血管性认知功能障碍(VCI)是指由于一系列血管危险因素所导致的脑部血管性梗阻进而影响人类认知功能的一大类综合征。近年来，我国血管性痴呆发病率逐年上升，然而治疗上仍缺乏高效明确的治疗药物。故及早防治血管性痴呆、改善认知功能障碍意义重大。因此VCI动物模型的有效建立对研究VCI的发病机制、药物治疗有着重要意义。

1 手术法

1．1 四血管阻断法(4-VO)

四血管阻断法最早由Pulsinelli等[1]于1979年提出，将大鼠麻醉后取颈部正中、枕骨后正中切口，电凝针烧灼双侧椎动脉造成永久性闭塞，大鼠苏醒后使用动脉夹夹闭双侧颈总动脉最后缝合。田茂等[2]对4-VO法进行改良，将SD大鼠麻醉后暴露双侧第一颈椎横突翼小孔，电凝针凝闭双侧椎动脉，24 h后行双侧颈动脉夹闭术，每次夹闭5 min共3次，每次间隔1 h最后缝合。术后海马神经元细胞损伤增多，血清中H2S浓度较正常组降低(P<0.05)。4-VO法是国际公认、较经典的全脑缺血模型建造方法，但此类手术方法存在一定难度，手术步骤复杂，与实验操作人员熟练度紧密关联，模型大鼠死亡率高，成活率较低，且风险较大，故此法在实验中并不常用。

1.2 三血管阻断法(3-VO)

三血管阻断法最早由Kameyama M[3]等于1985年提出，手术大鼠麻醉固定后，在甲状软骨上缘钝性分离肌肉至枕骨的腹面，在骨窗下电凝基底动脉，次日行夹闭双侧颈总动脉术。该法可快速制作全脑急性脑缺血模型，但在术中对周围组织神经牵拉较严重，尤其是在暴露及电凝基底动脉时易损伤延髓，大鼠死亡率高[4]。周越菡等[5]采用Kameyama M[3]的方法加以改良，结扎C57BL/6小鼠延髓腹侧面基底动脉，24 h后结扎双侧颈总动脉。术后海马区尼氏染色示CA1区神经元损伤，且CA1区病理发现结扎10 min，大鼠CA1区细胞死亡可达50%。叶伟光等[6]采用夹闭双侧颈总动脉+提线法阻断基底动脉建立模型，暴露大鼠双侧颈总动脉，分离基底动脉于股动静脉穿刺置管。待呼吸、心率平稳后，夹闭双侧颈总动脉，提线法阻断基底动脉均10 min。术后大鼠血脑屏障破坏，通透性增加，脑组织核因子、肿瘤坏死因子含量表达增加。

1.3 两血管阻断(2-VO)

两血管阻断法是国内较常用的造模方法，造模[7]于颈部正中切口，分离双侧颈总动脉并永久性结扎，结扎时避免触碰迷走神经。该方法操作简便，其原理是通过缓慢低灌注导致大鼠脑部慢性缺血。模型大鼠术后出现明显认知功能障碍，但不影响正常肢体活动。目前认为两血管阻断法可行性佳，动物存活率较高，适合进行慢性脑缺血模型研究，亦是血管性痴呆最常用的动物模型[8]。苏军红等[9]采用该法制作VCI动物模型，4周后大鼠前脑皮层单胺类神经递质如NE、DA、5-HE含量均较正常组下降(P<0.05)，单胺氧化酶MAO含量升高。

然同时结扎双侧颈动脉，易造成大鼠急性脑缺血死亡，死亡率高给实验带来诸多不变，因此对2-VO进行改良至关重要。黄新武[10]等采用间隔4 d分别结扎双侧颈动脉血管，大鼠成活率高，且学习记忆能力显著下降，血流变学指标明显异常,TNF-α、IL-1β、NO、MDA含量明显升高,NOS活性显著增加,SOD活性明显降低。田先翔等[11]采用Wistar大鼠进行夹闭双侧颈动脉5 min后复灌1 h，连续重复3次后永久性结扎双侧颈动脉血管。大鼠EEG脑电波频率变慢，振幅逐渐减小甚至呈一直线,复灌后以上现象逐渐消失且EEG恢复不完全。毛玲[12]等通过该法造模后发现血脑屏障被破坏，海马区锥体细胞和神经纤维受损，且该变化与基质金属蛋白酶MPP9含量增加有关。该方法操作简便且大鼠成活率高，造模较成功。

1.4 双侧颈总动脉狭窄法(BCAS)

该法模拟临床颈动脉狭窄的患者，通过短时间反复、多次夹闭动物双侧颈总动脉造成动物脑部慢行缺血达到目的。Shibata[13]采用该方法，将两直径为0.18 mm的线圈放入小鼠双侧颈总动脉处，术后5～6个月小鼠学习记忆能力明显下降。外径向臂、巴恩斯迷宫和莫里斯水迷宫表明，BCAS模型复制了VCI的一些特征，特别是工作记忆的缺陷。罗永坚等[14]将大鼠水合氯醛腹腔麻醉后，颈部正中切口分离并暴露双侧颈总动脉，套4号丝线扣并拉紧丝扣，同时将大鼠尾部放血1 ml，阻断血流20 min后，打开丝扣灌注10 min，重复1次后缝合皮肤，局部切口注射庆大霉素以防感染。术后1周大鼠脑组织光镜下可见，海马CA1区神经元细胞大量凋亡丢失、缺血以及坏死。

1.5 脑血管阻断法

陈惟昌等[15]采用脑血管直接定位阻断法建造模型。选取雌性昆明种小鼠42只，小鼠学习训练结束后，将 0.1%海人酸0.3ul溶于生理盐水中，向每只小鼠单侧右脑室注入1.407 nmol，并逐日测定其记忆量保持变化情况。研究发现，正常组与注射生理盐水组记忆量变化比较差异无统计学意义。注射海人酸组小鼠记忆保持量逐渐减低，且于术后第4天完全消失。而镜下观察CA3区海马神经元损伤明显，对于CA1区损伤不明显。该方法通过应用脑室微量注射海人酸，可选择性地破坏小鼠海马CA3区锥体神经元及相应苔状纤维突触连结区，该方法造模较成功。但对于如何精确定位脑室，对于实验者技术操作要求较高。

1.6 栓子法

1.6.1 线栓法 线栓法是栓子造模方法中较常使用的方法之一，较其他方法操作简便。Boltze J[16]等在对绵羊采用线栓法制造血管性痴呆模型中，组织病理学发现大脑内灰质白质均有病理性变化，包括胶质瘢痕形成、小胶质细胞激活、新血管形成替代。季兆洁[18]参照L.D.Wang[17]法进行改良制作模型，将大鼠麻醉后钝性分离右侧颈总动脉，结扎同侧颈总动脉近心端及颈外动脉分叉部，并反向拉直颈外动脉，于距离颈总动脉末端5 mm处剪口，将直径0.28 mm鱼线沿颈内动脉方向插入，深度约为(18.5±0.5) mm，于颈内动脉近心端结扎该动脉并缝合切口，2 h后抽出鱼线10 mm以使大脑中动脉再灌。大鼠术后苏醒可出现对侧肢体瘫痪、无力、站立行走不稳，提尾时左侧前爪内旋。该方法缺点是模型所应用的鱼线入颅后操作是在非直视下进行的，血流阻断与否无法直观体现[19]。此外实验动物个体差异如动脉血管大小粗细及放置的鱼线直径对模型建造的成功与否均有一定程度的影响。

1.6.2 血栓法 Takagi K[20]等在大鼠右侧颈内动脉注射直径700～900 μm的微球，注射15 h后大鼠出现卒中症状，并在大脑皮层、海马、纹状体部位最为明显。梅建勋等[21]对Ishimura[22]法进行改良，采用同种品系大鼠左心室采血、研磨、筛孔过筛后，取血栓栓子(1 mg)与生理盐水(0.3 ml)混匀制成混悬液，大鼠腹腔麻醉后暴露颈内、颈外、颈总动脉。暂时夹闭大鼠颈总动脉，于颈外动脉逆行注入一定量的血栓栓子溶液，并同时开放颈总动脉,结扎颈外动脉并缝合伤口。造模后大鼠在下丘脑、海马部位均出现不同程度神经元肿胀、变性及坏死。该法模拟人类多发性梗死痴呆的发病机制，通过将血栓注入大鼠脑部血管内，经颈内动脉使其脑部各动脉出现多发性缺血性梗塞。此法类似临床脑中风发病机制，较舌下注入铁粉法造成单一部位脑梗塞有一定程度的改善。然栓子的体积、大小、速度不同，易造成血栓在脑部动脉梗塞的位置、梗塞面积的不同，造模结果个体差异较大，模型不确定性因素较多。

1.7 注射铁粉

林坚等[23]将大鼠正中切开头皮暴露颅骨，在额前囟部前2 mm、左旁开2 mm安置电极，参考电极位于远额窦，小螺丝固定上述部位，同时在额部记录电极处正后方固定一小磁铁。水迷宫测试后，将四氧化三铁粉末(56.4 mg/kg)溶于1.5 ml生理盐水中，于1 min内注入大鼠舌下静脉，分别于术后2 h、4 h、1 d、2 d、3 d观察大鼠行走、痛觉反应能力均有减弱，脑组织肉眼及镜下均可见明显的血管性栓塞。该方法操作难度低，动物创面损伤小，可重复性强，死亡率较血管阻断法低，且模型成功率高。但该法造成血管性阻塞部位较为局限且单一，对于多部位缺血梗阻的动物模型无法进行有效模拟。

2 非手术操作

2.1 高半胱氨酸血症模型

半胱氨酸是公认的导致心脑血管疾病的高危因素。Sudduth等[24]发现，通过基因或饮食改变可导致半胱氨酸水平增高，可诱导动物出现认知障碍。将APP/PS1小鼠放置于缺乏维生素B6、B12、叶酸，富含蛋氨酸的环境中，建造高半胱氨酸小鼠模型。行为学水迷宫检测中，模型小鼠出现明显学习记忆能力障碍，此外小鼠品种、饲养方式对该模型的建造也有一定程度的影响。

2.2 2型糖尿病大鼠模型

Niedowicz 等[25]将痴呆小鼠与APPDNL/DNL 9 PS1P264 L/P264 L基因敲除的糖尿病小鼠杂交。该种小鼠模型没有出现β-淀粉样蛋白变性，但在Morries水迷宫测试中出现明显学习记忆能力障碍及病理学改变，包括海马胆碱能轴突受体、标记的星形胶质细胞增生、血管炎症等。糖尿病与痴呆均可导致血管样病变。该方法操作步骤简便，造模后大鼠未出现运动障碍。通过模拟糖尿病发病机制，导致大鼠出现血管样病变，但与临床VCI多因素发病不尽相同。

2.3 自发性脑卒中大鼠模型(SHR/SP)

由Yamori[26]在日本开发的WKY遗传变异大鼠模型。此种模型大鼠在出生3个月后收缩压达到200mmHg，平均约9个月即出现脑梗塞或脑出血，5个月即发现脑部血流量在额区减少。Yamori等发现，SHR/SP较WKY模型血管易脆性大，通过改变SHR/SP模型大鼠的喂养方式或对模型进行单侧血管结扎，可加速或减慢其形成血管性认知功能障碍的周期时间。但该种模型存活时间较短，一般多为9～12个月，且与临床VCI患者发病因素多元化不尽相同。同时该模型价格昂贵，其广泛应用于科研亟待进一步研究。

3 复合法

高血脂喂养复合法:邵瑛等[27]先采用两肾一夹高血压模型法制造高血压大鼠模型，术后1周喂养高脂饲料，再此基础上采用改良2-VO法制作高血压高血脂VCI大鼠模型。术后电镜下海马突触数目、囊泡数量少,在突触前膜处稀疏聚集。该法通过先造成大鼠心血管及微循环系统紊乱，导致大鼠高血压、高血脂继而发生大脑低灌注而致脑缺血模型。此模型建造与人类高血压病脑梗塞发病机制最为接近。

4 其他

近年来发现，哺乳动物较啮齿类动物更易建造血管性认知功能障碍模型。已有报道，在家养犬具有缺乏运动、血脂高等特点，犬类认知功能障碍的表现与临床VCI发病特征具有相似性[28]。Boltze J等[29]对羊进行MCAo手术，术后组织病理学发现脑白质发生病变，包括胶质瘢痕形成，小胶质细胞活化和新血管、泡沫状脂肪细胞的形成替代。Schutt[30]等发现，老年犬在晚期认知功能下降、大脑皮层萎缩、心室扩大的表现与人类VCI发病机理相似。

5 结语

目前血管性认知功能障碍发病机制尚不完全明确。近年来，对于血管性认知功能障碍模型建造方法也在不断探索。实验中常用两血管阻断法、栓子法，多采用Morries水迷宫检测学习记忆能力以评价其认知功能有无出现障碍。该模型建造主要存在模型动物死亡率高、操作技术水平要求高、大鼠个体差异影响较大且与临床VCI发病机制仍有一定差异等多种问题。

参考文献：

[1] PULSINELLI WA，BRIERLEY JB.A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat [J]. Stroke，1979，10(3):267-272.

[2] 田茂,井沆,董艳军,等. 外源性硫化氢对血管性痴呆模型大鼠学习记忆的影响[J]. 中风与神经疾病杂志,2014, 31(11):969-972.

[3] KAMEYAMA M，SUZUKI J，SHIRANE R，et al. A new model of bilateral hemispheric ischemic in rat-three vessel occlusion [J]. Stroke，1985，16(3):489-493.

[4] 曾贵刚,李峻,彭海东,等. 大鼠血管性痴呆动物模型的研究进展[J]. 中国比较医学杂志,2012(3):50-55.

[5] 周越菡. 一种改良型小鼠全脑缺血再灌注模型的制作[J]. 学园,2014,21(3):95-97.

[6] 叶伟光,王天龙. 羟乙基淀粉130/0.4对全脑缺血-再灌注损伤大鼠血-脑屏障的影响[J]. 中国现代神经疾病杂志,2010,10(4):456-461.

[6] WANG F，GENG X，TAO HY，et al. The restoration after repetive transcranial magnetic stimulation treatment on cognitive ability of vascular dementia rats and its impacts on synaptic plasticity in hippocampal CA1 area [J]. J Mol Neurosci， 2010，41(1):145-155.

[7] WALKER EJ，ROSEBERG GA. Divergent role for MMP-2 in myelin breakdown and oligodendrocyte death following transient global ischemia[J].J Neurosci Res，2010，88(4):764-773.

[8] 王丽晔,陈志刚,罗玉敏. 动物慢性脑缺血模型的研究现状[J]. 中国比较医学杂志,2014,24(4):67-73.

[9] 苏军红,徐晓臣,王英杰,等. 原花青素对血管性认知功能障碍大鼠脑单胺类神经递质含量的影响[J]. 山西医科大学学报,2016,47(2):124-126.

[10] 黄新武,李华,秦大莲,等. 不同时点分别结扎左、右颈总动脉建立大鼠血管性痴呆模型[J]. 中国老年学杂志,2010,38(4):2006-2007.

[11] 田先翔,梅琼彬,杨伟峰. 大鼠血管性痴呆模型的制作[J]. 湖北中医学院学报,2007,9(01):19-20.

[12] 毛玲. 血管性认知功能障碍大鼠模型血脑屏障改变与MMP-9表达的实验研究[D].武汉：华中科技大学,2007：20-35.

[13] SHIBATA MASUNARI,OHTANI RYO,IHARA MASAFUMI,et al. White matter lesions and glial activation in a novel mouse model of chronic cerebral hypoperfusion[J]. Stroke,2004,35(11):598-603.

[14] 罗永坚,蔺心敬,李吕力,等. 血管性痴呆模型大鼠海马神经元凋亡和病理改变的实验研究[J]. 中国老年学杂志,2008,18(28):1788-1790.

[15] 陈惟昌,于萍,李占魁,等. 破坏海马CA3区后小鼠记忆动力学变化[J]. 中日友好医院学报,1996,10(2):4-6.

[16] BOLTZE J, NITZSCHE B, GEIGER KD, et al. Histopathological investigation of different MCAO Modalities and impact of autologous bone marrow mononuclear cell administration in an ovine stroke model[J]. Transl Stroke Res, 2011,7(2):279-293.

[17] L D Wang，D Le，X J Gong，et al. [J]. Chinese Journal of Natural Medicines, 2008, 6(2):130-134.

[18] 季兆洁. 桃红四物汤对血管性痴呆大鼠学习记忆能力的影响及机制研究[D].合肥：安徽中医药大学,2015:10-16.

[19] 陈翔,高风超,田新英. 血管性痴呆动物模型的研究现状[J]. 医学综述,2013,19(13):2379-2382.

[20] TAKAGI K，TAKEO S. The model of stroke induced by microsphere embolism in rats [J]. Nippon YaKurigaku Zasshi，2003，121(6):440-644.

[21] 梅建勋,张云岭,张伯礼. 多发梗塞性痴呆大鼠模型的改进与应用[J]. 中国中西医结合杂志,2000,20(2):34-36.

[22] ISHIMURA M,MAEDA T KATAOKA S,et al. Effects of KP-496，a noveldual antagonist for cysteinyl leukotriene receptor 1 and thromboxane A2 receptor，on Sephadex-induced airway inflammation in rats [J].Biol Pharm Bull,2009,32(6):1057-1061.

[23] 林坚,王子栋. 血管性痴呆动物模型[J]. 中国应用生理学杂志,1998,11(1):90-93.

[24] SUDDUTH TL, POWELL DK, SMITH CD,et al. Induction of hyperhomocysteinemia models vascular dementia by induction of cerebral microhemorrhages and neuroinflammation[J].J Cereb Blood Flow MeTab，2013，33(5)：708-715.

[25] NIEDOWICZ DANA M，REEVES VALERIE L，PLATT THOMAS L. Obesity and diabetes cause cognitive dysfunction in the absence of accelerated β-amyloid deposition in a novel murine model of mixed or vascular dementia[J]. Acta neuropathologica communications,2014,10(2):234-235.

[26] YAMORI Y. Overview: studies on spontaneous hypertension-development from animal models toward man. Clinical and experimental hypertension[J]. Part A, Theory and practice,1991, 13(5):631-644.

[27] 邵瑛.“通督调神固本”电针法对高血压-高血脂复合血管性痴呆模型大鼠学习记忆干预的初步研究[J].针刺研究,2009,34(6):368-374.

[28] PEREZ-SANCHEZ AP, DEL-ANGEL-CARAZA J, QUIJANO-HERNANDEZ IA,et al. Obesity-hypertension and its relation to other diseases in dogs[J].Vet Res Commun, 2015，39(1):45-51.

[29] MADIGAN JB, WILCOCK DM, HAINSWORTH AH. Vascular contributions to cognitive impairment and dementia: topical review of animal models[J].Stroke，2016，47(7):1953-1959.

[30] SCHUTT T, HELBOE L, PEDERSEN LO, et al. Dogs with cognitive dysfunction as a spontaneous model for early Alzheimer’s disease: a translational study of neuropathological and inflammatory markers [J].J Alzheimers Dis, 2016,52(2):433-49.