凋亡细胞清除过程中相关信号及机制的研究进展①

张少龙 樊竑冶

(中国药科大学生命科学与技术学院，南京 210009)

1 凋亡细胞释放“find me”信号招募吞噬细胞

生理条件下，非专职型吞噬细胞和专职型吞噬细胞都具有清除死亡细胞的能力。但是非专职型吞噬细胞如上皮细胞只负责清除邻近的凋亡细胞，不具备迁移的能力，而专职型吞噬细胞具备运动能力，可以迁移到别的地方发挥吞噬作用。胸腺中有大量的凋亡细胞产生，而邻近的胸腺细胞却不具备清除能力，因此专职型的吞噬细胞就需要迁移过来发挥吞噬作用。研究表明，凋亡细胞能够通过释放一些介质来招募吞噬细胞，这些介质被定义为“find me”信号。

1.1溶血卵磷脂(Lysophosphatidylcholine,LPC) 第一个被定义的“find me”信号是LPC[1]。有趣的是，其他形式的溶血磷脂或LPC的代谢衍生物都不具有趋化吞噬细胞的功能[2]。LPC的释放并不是简单的胞内成分的泄露，因为释放过程中凋亡细胞的膜结构是完整的。LPC的释放依赖于caspase-3介导的磷脂酶A2的激活，磷脂酶A2可以水解膜脂质上的卵磷脂。后来研究显示胆固醇转运蛋白(ATP binding cassette transporter A1，ABCA1)可能对LPC的释放也很重要。ABCA1以ATP为能源，可以促进细胞内游离胆固醇和磷脂的流出。ABCA1的敲除能够减少巨噬细胞向凋亡细胞上清的趋化。但是研究者并没有证明这种作用是由于凋亡细胞上清中LPC特异性的减少所致[3]。

G2A是LPC的高亲和G蛋白偶联受体(G protein-coupledreceptors,GPCRs),它的敲除可以减少吞噬细胞向凋亡细胞上清的迁移。不过对于G2A是否为LPC的受体仍有争论，因为有研究显示LPC可以抑制G2A介导的信号——与不表达G2A的细胞相比，LPC能够明显抑制有G2A表达的细胞肌动蛋白的聚合。不同的吞噬细胞类型会表达不同的GPCRs和G蛋白。因此，LPC或其他的溶血磷脂在迁移方面的作用可能还依赖于吞噬细胞的特异类型。

1.2鞘氨醇1磷酸(Sphingosine-1-phosphate,S1P) S1P是溶血磷脂的一种，也可以作为“find me”信号。S1P是鞘磷脂的重要代谢产物，由鞘氨醇经鞘氨醇激酶(Sphingosine kinase,SphK)磷酸化合成。研究已证实凋亡细胞可以分泌S1P[4]，且SphK1在凋亡过程中是上调的。S1P的受体是G蛋白偶联受体家族，目前已发现有S1PR 1～5五种亚型，分别调节不同的生理功能。由于吞噬细胞表面可以同时表达几种S1PR，因此很难确定到底是哪种受体参与了吞噬作用。纯的S1P可以诱导巨噬细胞的趋化，然而没有证据直接表明来自凋亡细胞上清的S1P是趋化因子。另外，有研究者发现胞外的SphK1并没有增加，提示S1P是在胞内产生的。然而，他们并没有提到任何有关SphK2的作用，而SphK2在凋亡过程中是可以被分泌出去的，这就可能导致在胞外产生S1P[5]。因此，凋亡过程中S1P的产生以及对吞噬细胞的趋化仍需要进一步的研究。

1.3趋化因子CX3CL1(C-X3-C motif chemokine ligand 1,CX3CL1) 细胞凋亡过程中会释放小的囊泡。研究显示这些囊泡可以促进单核细胞向生发中心的凋亡B细胞趋化[6]。其中和凋亡囊泡相关的CX3CL1是一种趋化因子。CX3CL1是一个90 kD的膜结合趋化因子，在凋亡的早期阶段会产生一个 60 kD的片段，被包裹在PS外翻的微粒中释放。虽然CX3CL1的具体释放机制仍不清楚，但它对于吞噬细胞的趋化是依赖于CX3CR1的。有研究表明CX3CR1缺失的巨噬细胞不能向凋亡的B细胞迁移。组织蛋白酶S的加工可以产生55 kD的可溶形式的CX3CL1，但是它并没有结合在微粒上[7]。因此60 kD的CX3CL1到底是如何产生的又是如何被包装进微粒的，这些问题仍需要进一步的研究。与成熟的糖基化CX3CL1(90 kD)相比，非糖基化的胞内片段在50～60 kD之间。有一个有趣的猜测，凋亡会抑制CX3CL1的糖基化,导致非糖基化蛋白的增加。膜起泡过程中囊泡的释放也许是一个CX3CL1释放的可能机制。值得注意的是caspase-3存在于囊泡内，这也提示我们CX3CL1的切割也可能发生在微粒释放后。

1.4核苷酸(Nucleotides) 核苷酸同样可以作为“find me”信号[8]。ATP、UTP可以从凋亡细胞中以时间和caspase依赖的方式释放。核苷酸释放时凋亡细胞的膜结构是完整的，它是通过缝隙链接蛋白(Pannexin-1，Panx1)通道释放的[9]。凋亡过程中caspases-3和caspase-7会切割Panx1的C端,Panx1 C端的切割导致通道的开放，核苷酸便可通过它释放到胞外空间。值得注意的是，虽然在胞内ATP的浓度要高的多，但释放到胞外的ATP和UTP的浓度却相差不大。因此究竟是Panx1更容易选择UTP,还是UTP更容易被释放，或是ATP在凋亡过程中被代谢降解了，这些问题仍然有待研究。

其中，嘌呤受体(Purinoceptor)中的成员P2Y2受体是ATP的重要受体。有研究表明，P2Y2 可以介导吞噬细胞的趋化。P2Y2敲除小鼠的吞噬细胞向在体外表现出向凋亡细胞培养上清的趋化能力减弱，且该小鼠体内存在胸腺细胞的清除损伤。由于细胞表面表达多种嘌呤受体，因此对于ATP/UTP在吞噬作用中是否还具有其他的功能需要进一步的研究。

1.5其他的“find me”信号 凋亡细胞还会分泌其他的可溶性的介质来调节吞噬细胞的迁移。例如核糖体蛋白S19(Ribosomal protein S19，RP S19)的二聚体[10]。研究表明只有RP S19的二聚体而非单体才能诱导单核细胞的迁移。补体成分C5a的受体CD88可以感受RP S19，介导单核细胞的迁移[11]。虽然中性粒细胞同样表达CD88，但二聚体的RP S19不会诱导中性粒细胞迁移。这被认为是RP S19 C端部分的原因，因为它可以拮抗多形核白细胞的受体。

内皮单核细胞激活肽Ⅱ(Endothelial monocyte activating polypeptideⅡ，EMAPⅡ)和人的酪氨酰-tRNA合成酶(human tyrosyl tRNA synthetase，TyrRS)也具有趋化性质。它们都需要蛋白酶解加工才具有趋化性质[12]。EMAPⅡ可能是pro-EMAPⅡ经caspase-7切割产生的。TyrRS被认为是由中性粒细胞释放的弹性蛋白酶产生。TyrRS切割产生的C端和EMAPⅡ具有49%的同源性。TyrRS的N端可以通过膜蛋白CXCR1刺激吞噬细胞迁移。EMAPⅡ可以通过CXCR3促进由单核细胞分化的内皮祖细胞迁移,但是还没有证据显示这和凋亡细胞的清除相关。EMAPⅡ和TyrRS可能是在凋亡后期释放的，也就是这些细胞的次级坏死状态。虽然研究者可以证明凋亡细胞分泌的EMAPⅡ和TyrRS可以调节趋化性，但缺乏直接的证据证明它们是凋亡细胞培养基里的趋化成分。

2 凋亡细胞释放“keep out”信号排斥炎性细胞

凋亡细胞除了会通过分泌“find me”信号吸引一些吞噬细胞，还会分泌某些因子来排斥一些炎症细胞，例如中性粒细胞。就目前的研究来说乳铁蛋白是唯一的已知“keep out”信号[13]。多种细胞被诱导凋亡后乳铁蛋白的表达都是上调的。并且纯的乳铁蛋白在体内外都可以抑制中性粒细胞的趋化性。乳铁蛋白也可以抑制嗜酸性粒细胞的募集，但是它对单核细胞或巨噬细胞向补体成分C5a的趋化却没有影响。这表明了乳铁蛋白可以选择性地抑制中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的迁移。

3 凋亡细胞释放“eat-me”信号介导吞噬作用

细胞死亡的环境是复杂的，有多种细胞存在，包括死亡细胞、健康细胞、免疫细胞。吞噬细胞必须从众多细胞中区分出死亡细胞，这样才能保持组织稳态，促进正常的发育并避免不期望的炎症发生。因此死亡细胞必须把自己转变成吞噬的靶标，显示出独特的信号以区别于活细胞。这种信号被称作“eat-me”信号，它可以和吞噬细胞上的相关受体特异性结合，介导吞噬作用。

3.1磷脂酰丝氨酸(Phosphatidyl serine，PS) PS是最著名的“eat-me”信号，在吞噬作用中发挥着最基本的作用[14]。正常情况下，活细胞的PS只存在于脂质膜的内侧，在凋亡过程中PS被激活并以依赖caspase的方式迅速外翻到细胞外侧。凋亡细胞外翻的PS可以被多种吞噬细胞上的膜受体和桥梁分子所识别。吞噬细胞上的膜受体包括T细胞免疫球蛋白黏蛋白受体4(T-cell immunoglobulin mucin receptor 4 ，TIM4)、脑特异性血管生成抑制因子1(Brain-specific angiogenesis inhibitor 1，BAI1)等。桥梁分子包括牛乳脂球表皮生长因子8(Milk fat globule epidermal growth factor 8，MFGE8)、蛋白S(Protein S)和生长停滞特异因子6(Growth arrest-specific 6,Gas6)等。

3.1.1BAI1 BAI1属于G蛋白偶联受体中的一个亚家族。BAI1通过血小板反应蛋白重复序列，可以直接和PS结合[15]。在识别PS的基础上，BAI1可以和细胞质中的信号模块ELMO1-DOCK复合物相互作用。ELMO1和DOCK复合物具有鸟嘌呤转换因子的作用，它可以激活Rac1,然后诱导肌动蛋白细胞骨架的重排，促进对凋亡细胞的吞噬。全身敲除BAI1的成年小鼠与野生型小鼠相比，骨骼肌细小，并且在骨骼肌受伤后的愈合变得缓慢。由于成肌细胞的融合同样涉及PS的外翻，这些结果可能反映出了BAI1的其他有趣功能[16]。在腹腔巨噬细胞中，BAI1和凋亡细胞的PS结合后会触发信号促进胆固醇的外流，这有助于脂质代谢的平衡。研究表明，BAI1缺陷小鼠的巨噬细胞显示出其吞噬凋亡细胞能力的降低。有趣的是，尽管巨噬细胞中BAI1的mRNA水平显著低于TIM4的mRNA水平，但BAI1和TIM4 缺陷小鼠的巨噬细胞在吞噬凋亡细胞能力上的损伤却相差不大。有关BAI1 mRNA和蛋白水平的直接相关性研究还未被报道过。由此推测，BAI1的表达可能有转录后调控或者BAI1可能存在并不需要高表达就能调控吞噬作用的机制。

3.1.2TIM4 TIM4属于细胞表面的糖蛋白，最初是由于在调节T细胞方面的作用而被定义命名的。不像BAI1、TIM4仅仅是作为吞噬细胞上的捕获受体与PS结合而没有传递信号的作用[17]。一项针对斑马鱼的研究显示BAI1和TIM4可能在吞噬过程中的不同阶段发挥作用。BAI1促进吞噬体的形成，TIM4则有助于吞噬体的稳定[18]。在小鼠中,TIM4在组织原驻型巨噬细胞、树突状细胞中高表达，特别是腹腔巨噬细胞。TIM4缺失的巨噬细胞吞噬凋亡细胞的能力减弱[19,20]。全身TIM4 缺陷的小鼠也更容易发展成自身免疫病，过表达TIM4的小鼠显示出次级免疫应答的减弱。这些数据表明TIM4可以影响自我平衡下的凋亡细胞的清除,还和潜在的免疫耐受有关系。

3.1.3Gas6/Protein S Gas6/Protein S是TAM受体酪氨酸激酶(Tyro3/Axl/Mer receptor tyrosine kinases)的共同配体。TAM受体属于蛋白酪氨酸激酶的一个亚家族。TAM受体主要由3个成员组成:Tyro3、Axl和Mer。TAM 配体Gas6或Protein S同时与暴露在凋亡细胞胞膜外侧的PS以及表达在吞噬细胞表面的TAM受体相结合，引起TAM构象发生变化，形成同源或异源二聚体，胞内段酪氨酸残基发生磷酸化，激活受体本身的酪氨酸蛋白激酶活性，催化下游分子，进而清除凋亡细胞[21]。尤其是Gas6/Mer在巨噬细胞清除凋亡细胞中作用重大，有较多报道[22,23]。针对TAM基因敲除小鼠的研究发现，小鼠中吞噬细胞的功能受损，凋亡细胞的清除出现损伤，导致了凋亡细胞及其膜细胞器堆积过多，并作为自身抗原激活自身免疫反应，诱发机体免疫功能紊乱。

3.1.4MFGE8 MFGE8是一种存在于多种物种体内的亲脂性糖蛋白。在吞噬细胞清除凋亡淋巴细胞过程中，MFGE8的C端与PS结合，N端则与吞噬细胞上的整合蛋白αvβ3、αvβ5相结合，介导吞噬细胞对凋亡细胞的识别和吞噬[24]。MFGE8在吞噬细胞和凋亡细胞之间起到桥连作用，促进了凋亡细胞的清除，这对于机体内环境的稳定十分重要。Hanayama等[25]的研究证实，与野生型动物相比，MFGE8缺陷型动物的腹腔巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬能力减弱。另外，成年MFGE8缺陷型动物可引起自身免疫性疾病，出现一系列的症状例如脾脏增大、血清中抗DNA抗体和抗核蛋白抗体显著增加以及由循环抗体在肾脏的沉积引起的肾小球肾炎等。

3.2其他的“eat-me”信号 研究表明，还有一些信号也可作为“eat-me”信号。它们很可能有一个“捕获”功能，促进吞噬细胞对凋亡细胞的识别。凋亡细胞表面的细胞间黏附分子3(Intercellular adhesion molecule 3，ICAM3)、钙网蛋白(Calreticulin)、氧化的低密度脂蛋白(Oxidized low-density lipoprotein)、糖基化蛋白(Glycosylated surface proteins)等也可以作为“eat me”信号。而吞噬细胞上也存在可以和它们相互识别的受体。例如，吞噬细胞表面的CD14可以结合ICAM3，CD91可以借助C1q识别钙网蛋白，清道夫受体可以结合氧化的低密度脂蛋白，凝集素能够识别凋亡细胞表面的糖基化蛋白。

4 阻止吞噬作用的“don′t eat me”信号

和“find me/keep out”信号相似，同样有信号扮演着阻止吞噬作用的角色。虽然PS是细胞死亡的一个标志，但是活细胞偶尔也会出现PS的被迫外翻或正常生理条件下的外翻[26]。但是活细胞却不会被识别和吞噬，它可能是通过表达一些“don′t eat me”信号来抑制吞噬细胞的吞噬，例如CD31、CD46、CD47。活细胞可能通过这些信号向吞噬细胞表明，虽然有PS的外翻，但“我”并不需要被吞噬。

有研究表明，活细胞上的CD47和巨噬细胞上的信号调节蛋白α(Signal regulatory protein α ，SIRPα)的相互作用可以负向调控吞噬作用[27]。反之凋亡过程中CD47的重新分布和缺失可能会促进凋亡细胞的清除。凋亡中不同细胞类型上补体调节蛋白CD46的减少可以增强补体的调理素作用，增加吞噬细胞对它们的识别[28]。同样，活细胞上的CD31可以和吞噬细胞上的CD31相互作用，提供一个空间上的排斥作用来抑制吞噬作用。不同细胞类型CD31的表达情况不同，但是对于某些白细胞来说，CD31的下调对于有效率的吞噬作用是必要的。总之，凋亡细胞表面的“eat me”信号的充分暴露以及“don′t eat me”信号的减少对于吞噬细胞的吞噬作用来说都是必不可少的。

5 吞噬作用的胞内信号

凋亡细胞的吞噬作用涉及类似于巨胞饮作用的包膜边缘波动。PS和PS受体的相互作用会引起细胞骨架的重排。这一过程是由小GTPases Rho家族调节的。这个家族成员有RhoA、ROCK、Rac、Rab5、Cdc42。这些GTPases 静息状态是GDP结合状态，激活状态是GTP结合状态。由静息状态到活化状态的转变可以由特异性的鸟嘌呤核苷酸转换因子(GEFs)调节，例如由DOCK180和ELMO1形成的复合物[29]。最终，吞噬作用的信号在胞内汇集，激活进化上高度保守的Rac1，形成吞噬环，通过Scar/WAVE复合体促进肌动蛋白聚合和细胞骨架的重排[30]。

如前文所述，凋亡细胞表面的PS可以与巨噬细胞上的多种吞噬受体结合，因此不同的吞噬受体介导的胞内信号具有一定的差异性。例如，一旦PS结合整合素αvβ3或通过桥梁分子结合TAM家族受体后，就会与吞噬位点的适配蛋白ELMO1和DOCK180相互联系作用。BAI1同样需要激活DOCK180/ELMO1复合体来调节吞噬作用，但是它可以独立的招募这个复合体。然而Stabilin-2 和CD91/LRP却需要借助激活适配蛋白PTB domain-containing engulfment adaptor protein 1(GULP)来促进吞噬作用[31]。TIM4的胞内序列非常短，目前认为它只具有结合PS的作用，而不具备传导信号的作用。

6 凋亡细胞清除障碍与系统性红斑狼疮

生理条件下，凋亡细胞的清除过程是免疫耐受的。如果凋亡细胞的清除出现障碍，则会引起凋亡细胞的积累。积累的凋亡细胞进入次级坏死状态，释放胞内物质，并作为自身抗原诱发自身免疫反应进而导致自身免疫病，如系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)。有关研究已显示在SLE小鼠及患者中，均存在凋亡细胞的清除损伤。并且，多种参与凋亡细胞清除的分子和SLE高度相关。Mer敲除小鼠表现出急性肾损伤，肾小球增生、坏死以及炎症细胞的浸润和广泛自身抗体沉积等SLE样特征[32]。MFGE8缺失小鼠中，其淋巴结出现凋亡淋巴细胞的积累，并发展为SLE样病变，包括自身抗体的形成、脾肿大以及肾炎[33]。狼疮患者中有一小部分存在MFGE8的基因多态性及拼接异常，表明在这些患者中可能存在着和MFGE8相关的凋亡细胞清除异常[34]。另外，补体成分在凋亡细胞的清除及自身免疫疾病的发展中也有着关键的作用。据报道，补体成分的缺失，尤其是C1q，和SLE高度相关[35]。这些研究表明，凋亡细胞的清除障碍与SLE的发生发展密切相关。因此，对于凋亡细胞清除的分子机制的研究可能会为SLE的治疗提供新的靶点。

7 结语

凋亡细胞的清除对于维持组织稳态至关重要。研究者们对于凋亡细胞清除的不同阶段进行了广泛而深入的研究。但是仍然有很多问题有待阐明。第一：在凋亡细胞被清除的地方往往存在多种类型的吞噬细胞，它们之间是否存在相互作用以及它们对凋亡细胞的吞噬是否存在竞争关系仍不清楚。第二：目前关于“find me”信号的认识十分有限。一些“find me”信号只是在体外被证明对吞噬细胞具有趋化作用，而在体内它们是否具有招募作用仍需要进一步的研究。另外，一些“find me”信号的释放过程仍不清楚，例如 CX3CL1。并且，对于某些“find me”信号来说，它们在吞噬细胞上的受体也没有被确切定义，例如LPC、S1P。第三：吞噬细胞的吞噬受体不仅具有识别凋亡细胞“eat me”信号的作用，还具有向胞内传递信号的功能。不同的吞噬受体向胞内传递不同的信号，因此吞噬作用的胞内信号传导过程仍有待进一步阐明。第四：凋亡细胞的清除损伤会导致一系列的疾病。而在这些疾病中，具体是凋亡细胞清除过程中的哪个阶段(招募、识别、吞噬)甚至于哪些相关分子出现了异常，仍需要更深入的研究。

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