警报素既是免疫警报又是疾病警报①

全紫瑶 谢圣高 崔天盆

(武汉市第一医院检验科，武汉 430022)

病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)是指某些病原体及其产物所共有的高度保守、可被模式识别受体识别结合的特定分子结构，如革兰氏阴性菌的脂多糖(LPS)、革兰阳性菌的磷壁酸、细菌鞭毛蛋白以及细菌DNA等，它们能与免疫细胞表面的模式识别受体(Pattem recognition receptor，PRR)结合，如糖基化终产物受体(Receptor for advanced glycation end products,RAGE)，Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)等激活相应的信号通路，产生炎症反应[1]。

1994年，Matzinger等[2]提出一种“危险信号”假说，即免疫系统可能不会进化到具备识别自我和非我的能力，而只能够感受到“危险”。当机体处于应激状态，或受到无菌性创伤和炎症刺激时，白细胞和上皮细胞释放内源性生物介质也称为危险相关分子模式DAMPs(Danger-associated molecular patterns，DAMPs)，使机体“感受到危险”，并通过趋化和激活抗原递呈细胞(APC)等免疫细胞增强固有和适应性免疫应答。2005年Oppenheim等[3]将满足以下三个生物学特征的这些内源性分子定义为警报素：①由细胞受到损伤或非程序性死亡，迅速释放出来，以抵抗感染和组织损伤；②对APC具有趋化和激活作用；促进受损组织的修复和再生[3]。

近年来，有研究者提出，当没有细胞损伤和死亡，活细胞在受到压力和生理应激时，也能释放在细胞内外发挥不同特定功能的蛋白质也称为Alarmins,这种类型的警报素被定义为压力素(Stressorins)。这些压力大致可分为三类：①化学和基因毒性压力：大量的环境污染物如烟雾和烃类会改变肺部微环境，IL-33分泌增多，导致过度的炎症反应。②代谢压力：糖尿病、肥胖症、厌食等其他代谢性疾病与体内代谢异常，形成促炎环境。③氧化应激压力：癌症患者体内产生自由基和可溶性介质如：花生四烯酸的代谢产物、细胞因子、趋化因子，进一步诱导活性氧自由基的生成。压力素促进细胞外压力传导到微环境，有助于组织修复。当受到长时间和高强度的生理应激时，压力素持续释放，不断传递危险信号，引发慢性炎症可导致病理损伤[4]。

目前发现的警报素家族成员主要包括以下几类：①抗菌肽(Antimicrobial peptides and proteins，AMPs)家族，哺乳动物的抗菌肽主要分为两大类：防御素(Defensins)和Cathelicidins(具有保守的Cathelin区域的抗菌肽)；②高迁移率族蛋白(High mobility group,HMG)，一种含量仅次于组蛋白的染色质结合蛋白,研究较多的是高迁移率族蛋白B(High mobility group B,HMGB)、高迁移率族蛋白N(High mobility group N,HMGN)及高迁移率族蛋白A(High mobility group A,HMGA)；③白细胞介素-1(IL-1)家族中研究较多的是IL-1α及IL-33；④热休克蛋白(Heat shock proteins，HSPs)家族，广泛存在于原核生物与真核生物中，在热休克、氧化应激等多种细胞损伤时合成；⑤ S100蛋白(S100 proteins)钙结合家族，研究较多的是S100A8和S100A9；⑥三磷酸腺苷(ATP)嘌呤家族；⑦冷诱导RNA结合蛋白(Cold-inducible RNA binding protein,CIRP)是DAMP的新成员，属于冷休克蛋白(CSPs)[5-7]。在没有损伤和感染时，警报素发挥着重要的生理功能。在压力和生理应激、组织损伤、炎症反应时迅速释放，激活和增强机体免疫防御系统。除此之外，有研究发现警报素也是炎症强有力的调停者，参与心脏、皮肤、神经系统等的修复和重构、炎症消退，对于维持组织稳态有重要作用，也是临床疾病诊断和治疗预后的分子标志物[8]。

1 警报素在急性创伤中的作用

研究表明,创伤后死亡率呈双峰分布，在严重损伤或出血性休克时出现第一重打击，刺激宿主固有免疫系统对炎症及时反应，且炎症反应的程度与损伤的严重程度有关。接下来，如果患者存活，系统性炎症就会被进一步增强，如缺血/再灌注、外科治疗和机会性感染时，将会导致第二重打击，出现第二次死亡高峰。第二重打击导致的“细胞因子风暴”，即诱导细胞过度和持续的释放促炎和抗炎性介质，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 等，致使多种器官功能障碍，增加了败血症风险[8，9]。

当机体受到非常严重的创伤时，HMGB1作为机体晚期的促炎介质，在30～60 min内释放，24～48 h达到顶峰[8]，致使各器官系统功能障碍(MODS)，发生全身炎症反应综合征(SIRS)，最后可能引发败血症。有研究显示，对无菌性炎症侵染的患者进行抗HMGB1治疗，有助于缓解出血性休克、局部缺血/再灌注、急性肺损伤、心肌缺血、大脑缺血性卒中的患者病情。此外，当体内LPS含量稍有升高，S100A8/S100A9复合物在体内的水平会随之增加，使用S100A8/S100A9阻断剂可以提高患者存活率[8，9]。近来，人们越来越关注线粒体来源的DAMPs在大量创伤性疾病中的关键作用，它在严重受伤的患者体内，呈显著性升高，通过激活中性粒细胞，诱导其迁移和脱颗粒，进而引起相关器官受损[10]。

2 警报素与慢性炎症反应

警报素招募不成熟DC，吞噬抗原，归巢到次级淋巴结，将抗原表位提呈给初始T细胞，导致适应性免疫应答，维持炎性状态。持续释放的警报素可能诱导MHCⅠ类和MHCⅡ类分子表达，提呈以前未遇到的抗原，同时促进抗原特异性T细胞分化，防止活化诱导的细胞凋亡，导致局部高炎症反应[8]。

在动脉粥样硬化(AS)病程中，平滑肌细胞(SMCs)、内皮细胞、巨噬细胞、泡沫细胞、活性血小板在受刺激的情况下会分泌HMGB1。当巨噬细胞被动脉粥样硬化斑块浸润时，HMGB1表达增多，诱导平滑肌细胞趋化，增强内皮细胞血管黏附因子的表达，有助于斑块中胆固醇晶体的形成，引发炎性反应[11]。氧化敏感性的S100A8/A9作为氧化产物的清道夫，避免细胞内其他成分受到氧化损伤，促进伤口愈合。此外，有研究表明，在斑块破裂后S100A12水平大幅上升，可作为评估冠状动脉疾病的生物学标记物[12]。

中风又称脑卒中(Ischemic stroke)或脑血管意外，是一组以急性起病，局灶性或弥漫性脑功能缺失为共同特征的脑血管病，发病前有长期的慢性基础病变，如高血压、动脉粥样硬化等[13]。中风后，神经元、神经胶质细胞和血管间质被破坏，非正常凋亡的死亡细胞的碎片释放HMGB1、HSP、ATP、S100蛋白等内源性DAMPs，激活免疫系统导致中枢神经系统损伤(Central nervous system，CNS)。卒中后，低灌注区域的细胞死亡,数小时内释放HMGB1，扰乱血脑屏障[14]；S100A8/A9是由缺血的脑组织中浸润性巨噬细胞释放，同样发挥促炎作用；死亡细胞释放类视黄醇X受体(PXRs)激活免疫细胞上的TLR2和TLR4，引发IL-1β、IL-23等炎性细胞因子的释放，对神经细胞起到保护作用，延迟炎症反应。缺血性脑卒中发生后，DAMPs在受损部位引发无菌性炎症，大约持续一周，且随着急性炎症加重组织损伤导致细胞进一步死亡，继而释放更多的DAMPs，这提示治疗中风可以从清除DAMPs入手。有最新研究详细阐述了卒中后损伤抑制机制，中风后3 d内，在缺血小鼠实验模型中，转录因子MAFB作为单核细胞和成骨细胞分化的重要介质，促进巨噬细胞清道夫受体(Macrophage scavenger receptor，MSR1)的表达，介导浸润的单核细胞吞噬DAMPs，清除炎症反应和防止神经损伤。PXRs激动剂可以促进MAFB的表达，Am80的作用最为明显，在卒中24 h后静脉注射Am80，MRS1表达下调，DAMPs内化明显，有效减少了神经损伤和梗死面积[15]。

老年痴呆症(Alzheimer′s disease，AD)是最常见的神经退行性病变，导致渐进性的记忆丧失和认知功能障碍。HMGB1、S100B、S100A8、HSP等直接参与到神经性炎症的免疫活动中。PRRs存在于AD患者的大脑小胶质细胞、星型胶质细胞、神经元和内皮细胞，当DAMPs大量释放时，激活信号传导通路，导致神经性炎症。往脑内室注射HMGB1，加速神经元细胞死亡和突触破坏，AD患者的临床症状进一步恶化。此外，HSP在退行性疾病中扮演着重要角色，各类神经元细胞如反应活性星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞都能诱导HSP70分泌，起到神经保护作用，还能促进神经细胞的正常功能[16]。

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种慢性的以中性粒细胞浸润为特征的慢性肺部疾病，导致慢性支气管炎、小气道纤维化和肺气肿，有害气体和颗粒是COPD的主要危险因素。Pouwels[17]及我们的研究均表明，吸烟人群相比于不吸烟人群的肺液或肺血清中HMGB1、S100A8/A9以及IL-37的含量有所增加。患者在受到香烟刺激时，促使内皮细胞释放IL-33，减少了Th2细胞相关细胞因子(IL-5、IL-13)的分泌，增加了其在巨噬细胞和NK细胞中的表达，促使TNF-α、IL-12和IFN-γ的释放，从而加重COPD患者炎症[18]。我们还发现吸烟导致凋亡清除分子乳脂球表皮生长因子8表达降低，导致死亡细胞清除减少，DAMPs进一步增加[18]。

3 警报素与自身免疫性疾病

在胶原诱导性关节炎或缺氧条件下，滑膜巨噬细胞和成纤维细胞主动分泌HMGB1，使得它在血清和滑膜液中的水平上升，所以类风湿性关节炎(RA)患者较正常机体有更高的HMGB1水平。研究发现，用抗HMGB1的单克隆抗体、血栓调节蛋白、重组HMGB1拮抗剂降低HMGB1的含量，能有效地减弱炎症，缓解RA[19]。血清和关节滑膜液中的IL-33在RA活动期大幅升高，当外用重组IL-33治疗，反而促使肥大细胞分泌大量促炎细胞因子，加重关节炎症[12]。此外，RA患者的巨噬细胞，中性粒细胞分泌S100A8/A9增多，且其在体内的浓度与疾病的严重程度有关[18]。关节滑液蛋白中S100A8/A9和S100A12的水平可特异性鉴别RA与其他类型的炎性关节炎[20]。另外，在系统性红斑狼疮患者体内，损伤皮肤或血清中HMGB1水平与疾病活跃程度呈正相关，有助于临床分期[12]。

4 警报素与肿瘤

HMGN1在抗肿瘤免疫中有多重生物学活性。首先，在细胞核内，HMGN1作为染色质的结合蛋白，调节染色质结构、基因表达和核心组蛋白的翻译后修饰，影响DNA修复和肿瘤发展。其次，当遇到有害物质，细胞内钙离子变化以及炎症刺激时，上皮细胞释放HMGN1，细胞外的HMGN1可作为极化Th1的警报素，促进了先天性和适应性的抗肿瘤免疫应答[21]。HMGN1的抗肿瘤活性是对机体的保护作用，有助于DNA的修复，维持基因的完整性。另外，肿瘤也会影响到HMGN1的分泌，随着癌症的恶化，它在机体内的水平下降，细胞更容易发生突变[22]。S100A8/A9 也与许多肿瘤密切相关，通过激活 p38 MAPK,直接作用于肿瘤细胞，促进它的转移。此外胞外低浓度的S100A8/9也可以通过与RAGE受体结合，促进血管形成，有利于肿瘤生长。S100家族有效促进炎症，招募吞噬细胞，促进肿瘤细胞迁移和生长，有望成为抗肿瘤免疫的目标[23]。此外，肿瘤核心低氧坏死的细胞会释放HMGB1，维持炎症微环境，进一步促进肿瘤的生长和增加其侵袭性。最近有研究表明，死亡的癌细胞释放的警报素可以与抗癌治疗相结合，改善抗肿瘤免疫反应[11]。HMGB1对肿瘤是具有双重作用的，它既能是癌症发展的中心调控者，有助于肿瘤细胞增殖、转移、血管形成和免疫逃逸，又能与TLR4结合作用于成熟DC，促进炎症反应，激活抗肿瘤免疫，发挥抑制肿瘤的作用。临床上通过减少HMGB1受体，抑制肿瘤生长与转移，有助于抗肿瘤免疫[24，25]。

5 警报素与器官移植

器官移植是治疗终末期器官衰竭的一种手段，影响移植物的存活因素主要包括以下几个方面:①移植术后免疫抑制剂的长期应用会抑制患者正常的免疫系统，可导致严重的感染以及多种肿瘤的发生；②免疫抑制剂会产生包括肝肾毒性在内的多种毒性反应；③慢性排斥反应，是影响术后移植物存活的最主要因素[23]。

心脏移植失败的主要原因是由于慢性移植排斥反应所导致的血管阻塞、心肌缺血，最终使移植心脏失去功能或出现功能障碍。Miller等[26]通过小鼠体内实验发现，IL-33 可通过诱导 Th1 细胞向 Th2 细胞转换抑制移植后血管阻塞过程。此外，在慢性心脏排斥模型中，也证明 IL-33 可以通过增加 Th2 型细胞的比例和髓源性抑制细胞(Myeloid-derived suppressor cell，MDSC) 来延长移植心脏的存活时间。心脏移植小鼠预先接受IL-33 的治疗可能通过促进 Th1 细胞应答向Th2 细胞应答的转换，并增加免疫耐受的Treg和MDSC 的细胞数量，减少炎症反应，提高移植成功率[27]。

6 警报素作为分子标记物与治疗靶标

警报素可以作为分子标记物，它的表达与释放与组织损伤程度和炎症进程密切相关，可以用来评估疾病严重程度，提示临床及时干预，降低发病率，还有助于监测疗效和预后[8]。

针对警报素及其信号传导通路，通过免疫调节的方式进行临床治疗还有几个亟待解决的关键问题。①在面对参与临床疾病的多种警报素时，我们不确定它们之中是否存在某个警报素起主导作用，该如何去选择我们的治疗靶标？②选择好治疗靶标之后，如何降低其在体内的浓度？研究表明，使用中和抗体或者拮抗剂是较好的解决方法，由于不同的警报素在模式识别受体上的一致性，那么阻断这些受体或它们的下游胞内信号传导可能更为有效，但由于许多病原微生物与警报素共享模式识别受体，如TLR4，针对于这些受体的治疗可能增加感染的风险。③抑制炎症要有度，完全废除宿主防御也是有害的，会增加患者机会性感染和肿瘤发生的概率，损伤组织修复和重建途径。这个平衡问题涉及到剂量调节，需要加强对不同浓度警报素对应的生理功能的研究[8]。

7 挑战与展望

警报素与临床多种类型的疾病密切相关，可以作为合适的分子标记物，为疾病诊断提供可信赖的依据，对疗效和预后进行评估，也可应用于肿瘤治疗或与疫苗联合应用于感染预防。

参考文献：

[1] Vénéreau E,Ceriotti C,Bianchi ME.DAMPs from cell death to new life[J].Front Immunol,2015,6:422.

[2] Matzinger P.Tolerance,danger,and the extended family[J].Ann Rev Immunol,1993,12(1):991-1045.

[3] Oppenheim JJ,Yang D.Alarmins:chemotactic activators of immune responses[J].Current Opinion Immunol,2005,17(4):359-365.

[4] Rider P,Voronov E,Dinarello CA,etal.Alarmins:feel the stress[J].J Immunol,2017,198(4):1395-1402.

[5] Zanetti M.Cathelicidins,multifunctional peptides of the innate immunity[J].J Leukocyte Biol,2004,75(1):39-48.

[6] 苏斌涛,崔天盆.细胞死亡清除的趋化和危险信号分子[J].医学分子生物学杂志,2011,8(6):538-541.

Su BT,Cui TP.Chemokines and dangerous signal molecules of cell death clearance [J].J Med Mol Biol,2011,8(6):538-541.

[7] Khan MM,Yang WL,Brenner M,etal.Cold-inducible RNA-binding protein(CIRP) causes sepsis-associated acute lung injury via induction of endoplasmic reticulum stress[J].Scientific Rep,2017,7:41363.

[8] Chan JK,Roth J,Oppenheim JJ,etal.Alarmins:awaiting a clinical response[J].J Clin Invest,2012,122(8):2711.

[9] Ma KC,Schenck EJ,Pabon MA,etal.The role of danger signals in the pathogenesis and perpetuation of critical Illness[J].Am J Respir Crit Care Med，2018,197(3)：300-309.

[10] Zhang Q,Raoof M,Chen Y,etal.Circulating mitochondrial DAMPs cause inflammatory responses to injury[J].Nature,2010,464(7285):104.

[11] Boteanu RM,Suica VI,Uyy E,etal.Alarmins in chronic noncommunicable diseases:Atherosclerosis,diabetes and cancer.[J].J Proteomics,2016,153:21-29

[12] Bertheloot D,Latz E.HMGB1,IL-1α,IL-33 and S100 proteins:dual-function alarmins[J].Cell Mol Immunol,2017,14(1):43-64.

[13] Cully M.Neurological disorders:DAMPening damage after stroke[J].Nat Rev Drug Dis,2017,16(6):385-385.

[14] Samary CS,Pelosi P,Silva PL,etal.Immunomodulation after ischemic stroke:potential mechanisms and implications for therapy[J].Critical Care,2016,20(1):391.

[15] Shichita T,Ito M,Morita R,etal.MAFB prevents excess inflammation after ischemic stroke by accelerating clearance of damage signals through MSR1[J].Nat Med,2017,23(6):723-732.

[16] Venegas C,Heneka MT.Danger-associated molecular patterns in Alzheimer′s disease[J].J Leukocyte Biol,2017,101(1):87-98.

[17] Pouwels SD,Hesse L,Faiz A,etal.Susceptibility for cigarette smoke-induced DAMP release and DAMP-induced inflammation in COPD.[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2016,311(5):L881.

[18] Wang Y,Luo G,Chen J,etal.Cigarette smoke attenuates phagocytic ability of macrophages through down-regulating Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) expressions[J].Sci Rep，2017，7:42642.

[19] O′Reilly S.Pound the alarm:danger signals in rheumatic diseases[J].Clin Sci,2015,128(5):297-305.

[20] Nefla M,Holzinger D,Berenbaum F,etal.The danger from within:alarmins in arthritis[J].Nat Rev Rheumatol,2016,12(11):669-683.

[21] Yang D,Tewary P,de la Rosa G,etal.The alarmin functions of high-mobility group proteins[J].Biochim Biophys Acta,2010,1799(1):157-163.

[22] Yang D,Bustin M,Oppenheim JJ.Harnessing the alarmin HMGN1 for anticancer therapy[J].Immunotherapy,2015,7(11):1129-1131.

[23] Land WG,Agostinis P,Gasser S,etal.Transplantation and damage-associated molecular patterns(DAMPs)[J].Am J Transplantation,2016,16(12):3338-3361.

[24] Hernandez C,Huebener P,Schwabe RF.Damage-associated molecular patterns in cancer:a double-edged sword[J].Oncogene,2016,35(46):5931-5941.

[25] He SJ,Cheng J,Feng X,etal.The dual role and therapeutic potential of high-mobility group box 1 in cancer[J].Oncotarget,2017，8(38)：64534-64550.

[26] Miller AM,Xu D,Asquith DL,etal.IL-33 reduces the development of atherosclerosis[J].J Exp Med,2008,205:339-346.

[27] Yang,Han Z,Oppenheim JJ.Alarmins and immunity[J].Immunol Rev，2017，280(1):41-56.