MicroRNA-590-5p、microRNA-103、microRNA-34c-5p、Dicer及BRMS-1基因在肺癌中的表达研究*

陈莹，张若冰，杨凯云，谭慧，平妮娜，吴锡南，何越峰

（1.昆明医科大学 公共卫生学院，云南 昆明 650500；2.昆明医科大学第三附属医院胸心外科，云南 昆明 650118）

MicroRNA（miRNA）是非编码小分子RNA，长度约为22 nt，其被证实参与细胞的发育、代谢，以及细胞的死亡、凋亡等多种生物活动。近10年来研究证明，miRNA介导肿瘤的发生、发展[1]。肺癌是发病率、致死率高的疾病，多项研究发现正常组织和癌组织中miRNAs表达存在差异，部分miRNAs与肿瘤的发生、发展相关。miRNAs对肺癌的进展有影响[2-3]。研究显示miR-34c-5p和miR-103均可提高细胞的存活率，并促进细胞的增殖，miR-34c-5p属于miR-34c家族的一员，在多种肿瘤中呈低表达，而Dicer蛋白属于RNAseⅢ家族，与miRNA和siRNA的功能密切相关，是RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）的重要组成部分，并且可以影响细胞分化[3-4]。BRMS-1可通过调节细胞间缝隙连接信号转导及抑制癌基因的表达抑制癌转移[2、5]。本文采用实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR），检测肺癌组织和癌旁组织中miR-590-5p、miR-103、miR-34c-5p、Dicer及BRMS-1的表达量及相互关系，分析其与组织类型、临床指标的关系，探讨其在肺癌发生、发展过程中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2010年1月-2011年1月于昆明医科大学附属第三医院住院患者的手术切除的肺癌组织及癌旁正常组织，癌旁正常组织离癌组织＞5cm，将选取的组织分为肺癌组织组和正常组织组，每组样本47例。其中鳞癌15例、腺癌32例。患者均为汉族；年龄32～71岁，平均（54.91±9.62）岁；男性32例，女性15例；吸烟29例（62%）；饮酒22例（47%）；低分化18例，中分化28例，高分化1例。32例腺癌的免疫组织化学指标如下，GSTπ：5例阴性（-），15例弱阳性（+），9例阳性（++），3例强阳性（+++）；PgP：7例阴性（-），14例弱阳性（+），9例阳性（++），2例强阳性（+++）；TOPOⅡ：6例阴性弱阴性（-），20例弱阳性（+），6例阳性（++）；肺耐药蛋白：2例阴性（-），14例弱阳性（+），13例阳性（++），3例强阳性（+++）；与多药耐药相关蛋白（multidrug resistance-associated protein，MRP）：4例 阴 性（-），13例弱阳性（+），15例阳性（++）；P53：9例阴性（-），15例弱阳性（+），7例阳性（++），1例强阳性（+++）；Ki67：5%～90%平均数为32.67%。本实验均取得患者知情同意。

1.2 方法

癌旁正常组织取下后10min内放入预先装有RNA later（美国Ambion公司）溶液的试管中，先4℃浸泡8 h，然后放入-80℃冰箱中长期保存。通过查阅病理切片记录确认组织病理类型。

1.3 RNA的提取和定量

利用Trizol（美国Invitrogen公司）提取总RNA，NCode ™ VILO ™ miRNA cDNA Synthesis Kit和 EXPRESS SYBR® GreenER ™ miRNA qRT-PCR Kit（美国Invitrogen公司，A11193-052）进行逆转录，以上按说明书步骤操作。引物序列如下，miR-590-5p：CAGGAGCTTATTCATAAAAGTGCAG；miR-34c-5p：AGGCAGTGTAGTTAGCTGATTGC；miR-103：CAGCATTGTACAGGGCTATGA ；BRMS1：TGCAGCGGAGCCTCAAG与TCACATCCAGACAG AAGCCCT；Dicer：TGGGTCCTTTCTTTGGACTG 与CTGGTTTGCAGAGTTGACCA。miRNA下游引物为试剂盒提供，利用ABI7900HT（美国ABI公司）对5个RNA进行qRT-PCR，2-△△CT表示相对表达量。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，数据经过对数转化后为正态分布，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用t检验，相关分析采用Spearman法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组基因的表达特征

两 组miR-103、miR-34c-5p、Dicer及BRMS-1基因表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05），其中肺癌组织组miR-103、Dicer较正常组织组低，表达下调；肺癌组织组BRMS-1、miR-34c-5p较正常组织组高，表达上调。见附表。

附表 两组基因的表达特征 （n =47，±s）

组别 miR-590-5p miR-103 miR-34c-5p Dicer BRMS-1肺癌组织组 6.53±3.39 3.63±2.10 8.60±2.97 4.67±2.34 5.64±2.57正常组织组 5.77±3.53 7.49±1.75 6.90±3.28 6.76±2.73 2.37±2.33 t值 1.048 9.519 2.602 3.942 6.161 P值 0.149 0.000 0.005 0.000 0.000

2.2 肺癌组织RNA与免疫组织化学指标的相关性

miR-34c-5p与P53呈正相关（r=0.402，P=0.034），miR-103与多药耐药相关蛋白呈正相关（r=0.563，P=0.020），Dicer与P53呈负相关（r=-0.381，P=0.040）。

2.3 两组miRNAs与mRNA的相关性

正常组织组中Dicer与miR-590-5p、miR-103及miR-34c-5p呈负相关（r=-0.382、-0.369和-0.403，P=0.041、0.034和0.023），而肺癌组织组中均未发现有相关性。

3 讨论

随着越来越多关于miRNAs的研究，发现miRNAs在生物代谢过程中和病理过程中起着重要作用[6-7]。miRNA可影响大多数目标基因表达，近几年来大量的miRNA被定义为致癌基因或抑癌基因，比如miR-335、miR-206及miR-126在乳腺癌中视为癌转移的标志，宫颈癌中miR-126、miR-143及miR-145和肺癌中的miR-451被视为致癌基因[7-9]。miRNA成熟过程通常是由基因组转录出初始转录pri-miRNA，再由Dicer等组成的复合物切割形成成熟miRNA并加入RISC复合物，行使其生物学功能[10-11]。miR-590-5p在宫颈癌、肝癌组织中表达下调[10]，而本次研究发现肺癌组织中的miR-590-5p表达与癌旁正常组织比较无差异。miR-103在结肠直肠癌中为致癌基因[11-12]，而本研究证实miR-103在肺癌组织中表达下调。miR-34c-5p基因的研究甚少，本研究发现肺癌组织与癌旁正常组织中miR-34c-5p表达量有差异，在肺癌组织中表达上调。有研究显示Dicer在乳腺癌、口腔鳞状上皮细胞癌以及其他不同癌组织中表达异常[13-16]。本研究中Dicer在肺癌组织中表达下调。BRMS-1被证实在乳腺癌、黑色素癌、卵巢癌及鼻咽癌中表达下调，且可能与癌细胞的入侵、转移和患者的预后有关[17-18]。而在肺癌组织中BRMS-1表达上调，其原因需进一步研究。

本文肺癌组织中RNA与免疫组织化学指标的关系相关性研究发现，miR-34c-5p和P53呈正相关；miR-103和MRP呈正相关，Dicer与P53呈负相关。肺癌组织和正常组织miRNAs与mRNA的相关性研究发现，正常组织中Dicer与miR-590-5p、miR-103和miR-34c-5p均呈负相关，而肺癌组织中未发现有相关性。本研究提示癌组织与正常组织的4种基因表达量有差异，miR-103和Dicer在肺癌组织中表达下调，miR-34c-5p及BRMS-1表达上调。Dicer在前体基因转录为成熟基因过程中起到重要作用，推测肺癌组织中Dicer表达下调的原因，miR-34c-5p抑制Dicer基因的表达，可能由于miR-34c-5p结合在Dicer的位点上，使Dicer基因降解，而降低基因表达。

肺癌被视为威胁人类健康最常见的肿瘤之一，缺乏早期诊断方法，使其在世界范围内是病死率最高的肿瘤[19]。本研究得到了miRNAs、mRNA与肺癌之间关系的流行病数据，但研究中对Dicer仅限于关联研究，可进一步进行机制方面的深入探索。本次研究的意义在于通过对mRNA与miRNAs关系的探究，明确肺癌组织miRNAs表达异常与mRNA转运异常表达有关，对阐明miRNAs转录调控和miRNAs表达调控机制有重要的意义，接下来应从机制研究入手，深度研究Dicer对miR-34c-5p及miR-103基因的影响及其机制。

参 考 文 献：

[1]OROM U A, NIELSEN F C, LUND A H.Microrna-10a binds the 5′UTR of ribosomal protein mRNAs and enhances their translation[J].Mol Cell, 2008, 30(4):460-471.

[2]ZHANG W C, LIU J, XU X, et al.The role of mircoRNAs in lung cancer progression[J].Med Oncol, 2013, 30(3):675-683.

[3]SAITO M, SCHETTER A J, MOLLERUP S, et al.The association of mircroRNA expression with prognosis and progression in the early-stage, non-small cell lung adknocarcinoma:a retrospective analysis of three cohorts[J].Clin Cancer Res, 2011, 17(7):1875-1882.

[4]MALLETER M, JACQUOT C, RONSSEAU B, et al.miRNAs, a potential target the treatment of non-small-cell lung carcinomas[J].Gene, 2012, 506(2):355-359.

[5]LORIO M V, CROCE C M.MicroRNAs in cancer:small molecules with a huge impact[J].Clin Oncol, 2009, 27(34):5848-5856.

[6]LOPEZ-SERRA P, ESTELLER M.DNA methylation-associated silencing of tumor-suppressor microRNAs in cancer[J].Oncogene,2012, 31(13):1609-1622.

[7]NEGRINI M, CALIN G A.Breast cancer metastasis:a microRNA story[J].Breast Cancer Res, 2008, 10(2):203.

[8]WANG X, TANG S, LE S Y, et al.Aberrant expression of oncogenic and tumor-suppressive microRNAs in cervical cancer is required for cancer cell growth[J].PLoS One, 2008, 3(7):DOI:10.1371/journal.pone.0002557.

[9]WANG X C, TIAN L L, JIANG X Y, et al.The expression and function of miRNA-451 in non-small cell lung cancer[J].Cancer Lett, 2011, 311(2):203-209.

[10]ZHENG Z M, WANG X.Regulation of cellular miRNA expression by human papillomaviruses[J].Biochim Biophys Acta,2011, 1809(11-12):668-677.

[11]CHEN H Y, LIN Y M, CHUNG H C, et al.miR-103/107 promote metastasis of colorectal cancer by targeting the metastasis suppressors DAPK and KLF4[J].Cancer Res, 2012, 72(14):3631-3641.

[12]GENG L, SUN B, GAO B, et al.MicroRNA-103 promotes colorectal cancer by targeting tumor suppressor DICER and PTEN[J].International Journal of Molecular Sciences, 2014,15(1):8458-8472.

[13]FABER C, HORST D, HLUBEK F, et al.Overexpression of Dicer predicts poor survival in colorectal cancer[J].Eur J Canc (Oxford,England:1990), 2011, 47(9):1414-1419.

[14]JAKYMIW A, PATEL R S, DEMING N, et al.Overexpression of dicer as a result of reduced let-7 MicroRNA levels contributes to increased cell proliferation of oral cancer cells[J].Genes Chromosome Canc, 2010, 49(6):549-559.

[15]CHIOSEA S, JELEZCOVA E, CHANDRAN U, et al.Upregulation of dicer, a component of the MicroRNA machinery,in prostate adenocarcinoma[J].Am J Pathol, 2006, 169(5):1812-1820.

[16]LILIANA P CANTINI, LOURDES M ANDINO, CHRISTOPHER C ATTAWAY, et al.Identification and characterization of Dicer1e,a Dicer1 protein variant, in oral cancer cells[J].Molecular Cancer 2014, 13(1):190-205.

[17]BALGKOURANIDOU I, CHIMONIDOU M, MILAKI G, et al.Breast cancer metastasis suppressor-1 promoter methyla tion in cell-free DNA provides prognostic infor mation in non-small cell lung cancer[J].Br J Cancer, 2014, 110(8):2054-2062.

[18]CUI R X, LIU N, HE Q M, et al.Low BRMS1 ex pression promotes nasopharyngeal carcinoma metastasis in vitro and in vivo and is associat ed with poor patient survival[J].BMC Cancer,2012, 12:376.

[19]曾龙剑, 吴锡南, 杨凯云, 等.miR-10b、miR-18b及miR-130b在肺癌中的表达研究[J].中国现代医学杂志, 2014, 24(10):28-31.