超声辅助提取灰灰菜多糖工艺优化及其体外抗氧化活性

2018-01-22,,

食品工业科技 2018年1期

(商洛学院生物医药与食品工程学院,陕西商洛 726000)

灰灰菜(ChenopodiumalbumLinn)为藜科藜属一年生草本植物,遍布世界各地。全草皆可入药,性味甘平,具有清热利湿[1]、降压、保肝[2-3]、抑菌[4-6]和调节免疫功能[1]等诸多药理活性。国内外研究表明,食用灰灰菜能够预防贫血,促进青少年儿童的生长发育[7]。研究发现灰灰菜嫩叶中富含维生素、胡萝卜素和膳食纤维等营养成分以及多种无机盐[8-9]。此外,灰灰菜中碳水化合物的含量高达6.0%[8]。Cutillo等研究表明灰灰菜中主要含多酚类和木质素类成分[10]。有研究人员对灰灰菜中总黄酮[9]和叶黄素[11]展开了相关研究,但对灰灰菜中多糖的研究则鲜有报道。

目前,超声辅助提取技术在天然多糖类成分提取过程中的优势日益凸显[12],不仅可以大大缩短传统的水提醇沉法的时间,而且在一定程度上能够提高多糖得率[12-13]。此外,有研究表明,响应面法优化提取工艺比正交设计优化的条件更为全面,更能直观地反映各因素的交互作用[14-15]。本文以液料比、超声时间、超声温度、超声功率、乙醇浓度为考察因素,多糖得率为响应因子,采用响应面法优化超声辅助水提醇沉法制备灰灰菜多糖提取工艺;进一步采用DPPH法、ABTS法和邻二氮菲-Fe2+法测定其体外抗氧化活性,为灰灰菜多糖高效提取及其抗氧化剂开发提供理论依据,进而为以灰灰菜为原料的保健食品研发提供参考。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

灰灰菜 2016年4～5月采自陕西省商洛市洛南县古城镇中山村,经鉴定为藜科藜属一年生草本植物灰灰菜的新鲜嫩叶;1.1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS) 购于Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA);硫酸亚铁铵、邻二氮菲、柠檬酸、柠檬酸钠均为国产分析纯，购于天津科密欧化学试剂有限公司。

755B紫外-可见分光光度计上海精密科学仪器有限公司;BILON-1000CT超声波提取器上海比朗仪器制造有限公司;FA1104电子天平上海精科天平厂;LGJ-10冷冻干燥机郑州明天仪器设备有限公司;TGL-20bR高速冷冻离心机上海安亭科学仪器厂;RE-3000B旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂。

1.2实验方法

1.2.1 灰灰菜粗多糖(CAPs)的制备及含量测定制备流程:灰灰菜→粉碎(过60目筛)→超声辅助热水浸提→离心(4000 r/min)→取上清液(沉淀加水重复提取两次,合并三次上清液)→浓缩(100～200 mL为宜)→乙醇沉淀→离心(4000 r/min,重复两次)→沉淀加适量蒸馏水溶解→Sevage法除蛋白→透析→真空冷冻干燥→灰灰菜粗多糖。

1.2.2 CAPs制备的单因素实验以水作为提取溶剂、多糖得率为考察指标,按1.2.1流程提取CAPs。

1.2.2.1 液料比对多糖得率的影响固定超声时间为20 min、超声温度为70 ℃、超声功率为400 W、乙醇浓度为90%,考察提取溶剂水和材料的比例(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1和30∶1)对多糖得率的影响。

1.2.2.2 超声时间的影响在液料比20∶1、超声温度70 ℃、超声功率400 W、乙醇浓度90%条件下,考察超声时间(5、10、15、20、25和30 min)对多糖得率的影响。

1.2.2.3 超声温度的影响固定液料比20∶1、超声时间20 min、超声功率400 W、乙醇浓度90%,考察超声温度(40、50、60、70、80和90 ℃)对多糖得率的影响。

1.2.2.4 超声功率的影响以20∶1的液料比、超声时间20 min、超声温度70 ℃、90%的乙醇为固定条件,考察超声波功率(100、200、300、400、500和600 W)对多糖得率的影响。

1.2.2.5 醇沉时乙醇浓度的影响最后在液料比20∶1、超声时间20 min、超声温度70 ℃、超声功率400 W的条件下,考察乙醇浓度(50%、60%、70%、80%、90%和100%)对多糖得率的影响。

1.2.3 响应面优化CAPs提取条件在单因素实验的基础上,选择液料比、超声时间、超声温度、超声功率和乙醇浓度作为自变量,依据Box-Behnken设计,进行五因素三水平的工艺优化实验,以CAPs得率为响应值,利用Design Expert 8.05b软件对结果进行分析,因素水平设计见表1。

表1 响应面因子设计及水平表Table 1 Factors and levels in RSM design

1.2.4 多糖含量测定采用苯酚-硫酸法进行[16]。CAPs得率(%)=M粗多糖/M灰灰菜粉末×100

1.2.5 灰灰菜多糖体外抗氧化活性以维生素C(Vit. C)为阳性对照,CAPs对DPPH自由基和ABTS自由基的清除活性测定方法参照文献[16-17],对·OH自由基的清除能力采用邻二氮菲-Fe2+法测定[18]。

1.3数据处理与统计分析

实验方案设计和模型构建采用Design Expert 8.05b软件,数据处理采用Excel进行,统计分析采用SPSS 18.0软件中的单因素ANOVA进行。

2 结果与分析

2.1CAPs制备工艺单因素实验结果

2.1.1 液料比对CAPs得率的影响从图1中可以看出,液料比对多糖得率的影响呈现持续递增的趋势,在液料比为5∶1到15∶1之间,多糖得率几乎呈直线递增,而后增幅有所放缓,曲线没有极值点,在实验范围内曲线最大值为5.02%,此时的液料比为30∶1,说明液料比愈大愈能充分将有效成分提取出来,这一点与和法涛等的研究结果一致[19]。这是因为水作为溶剂,从灰灰菜中提取多糖的过程实质上是材料中的多糖分子不断向溶剂中扩散的过程,随着溶剂量的不断加大,多糖分子不断被溶出,逐渐达到某一平衡状态。即在20∶1附近溶剂和材料达到平衡状态,基于此,后续实验选取液料比20∶1。

图1 液料比对多糖得率的影响Fig.1 Effects of water-material ratio on the yield of polysaccharides

2.1.2 超声时间对CAPs得率的影响由图2可以看出,在前5～20 min内,CAPs得率快速增加达到峰值4.6%,而后逐渐下降。这是因为刚开始时溶剂中多糖含量较低,而原材料中的多糖含量高,多糖成分由原料内部向周围溶剂中扩散的动能较强,故随着超声时间的增加,多糖得率逐渐增大,达到峰值。但是在20 min后,延长超声时间多糖得率反而降低,这可能是由于随着时间的延长多糖物质逐渐分解的缘故。

图2 超声时间对多糖得率的影响Fig.2 Effects of ultrasonic time on the yield of polysaccharides

2.1.3 超声温度对CAPs得率的影响从图3中可以看出,在40～70 ℃,CAPs得率快速增加达到峰值,而后快速下降。这是因为刚开始加热时由于受分子热运动的影响,灰灰菜当中的多糖类成分浸出率逐渐增大,CAPs得率随着温度的增加而增加,在70 ℃是达到峰值。此后,随着温度的继续升高,导致多糖遇高温分解,进而出现多糖得率下降的现象。

图3 超声温度对多糖得率的影响Fig.3 Effects of ultrasonic temperature on the yield of polysaccharides

2.1.4 超声功率对CAPs得率的影响由图4可知,超声功率对CAPs得率的影响呈现先快速增加后缓慢减小的趋势,尤其是在300～400 W,多糖得率最高。这是因为超声波具有机械效应、空化效应和热效应,通过增大多糖分子的运动速度和溶剂的穿透力以提取出更多的多糖类成分,而这一作用受超声功率影响非常明显,功率过小不足以充分发挥超声波的作用,功率过大容易造成多糖分解。

图4 超声功率对多糖得率的影响Fig.4 Effects of ultrasonic power on the yield of polysaccharides

2.1.5 乙醇浓度对CAPs得率的影响从图5可知,乙醇沉淀时乙醇浓度对CAPs得率的影响呈现先快速增加后趋于平缓直至减小的趋势,乙醇浓度对多糖得率影响的峰值为5.11%,出现在乙醇浓度为90%的实验点。这是因为多糖类物质具有溶解于稀乙醇溶液不溶于高浓度的乙醇溶液的特性,故而利用这一性质对提取的粗多糖进行纯化。

图5 乙醇浓度对多糖得率的影响Fig.5 Effects of ethanol concentration of the yield of polysaccharides

2.2响应面优化CAPs提取条件

2.2.1 Box-Behnken设计与实验结果基于上述单因素实验结果,综合考虑各因素对多糖得率影响趋势,按照选定的因素水平表(表1)进行上述五个因素(液料比、超声时间、超声温度、超声功率和乙醇浓度)与CAPs得率之间的五因素三水平响应面实验,根据Design Expert 8.05b软件中的Box-Behnken实验设计原理,共安排46组实验,实验方案及结果如表2所示。

表2 灰灰菜多糖响应面的实验方案及结果Table 2 Results and experimental design of RSM on CAPs of Chenopodium album L.

利用Design Expert 8.05b软件程序对表2中的实验结果进行统计分析,对各因素回归拟合后,得到CAPs得率(Y)对液料比(A)、超声时间(B)、超声温度(C)、超声功率(D)和乙醇浓度(E)的五元二次回归方程:

Y=6.53572-0.02896A-7.12×10-3B-0.06384C+4.67×10-3D-0.05598E+6.5×10-4AB+2.5×10-4AC+2.75×10-5AD+1.67×10-5AE+1.33×10-4BC-4.5×10-5BD+2.33×10-4BE+4.5×10-5CD+3.0×10-4CE-5.0×10-6DE-4.0×10-5A2-4.6×10-4B2+1.5×10-4C2-7.7×10-6D2+3.6×10-4E2。

表3 灰灰菜多糖回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis with quadratic model of RSM on CAPs of Chenopodium album L.

从表3中可以看出,乙醇浓度对多糖得率的影响高度显著,而超声时间对多糖得率影响不显著,其余因素对多糖得率影响均为极显著。各因素交互作用对实验指标影响情况如下:超声温度与乙醇浓度交互作用对多糖得率影响显著,其余各交互项均不显著，其中液料比与超声时间(AB)、液料比与超声温度(AC)和超声温度与超声功率(CD)三个交互作用较大;超声功率和乙醇浓度二次项对多糖得率影响显著,其余均不显著。

注:** 表示p<0.01,差异极显著;* 表示p<0.05,差异显著。

2.2.2 响应面分析图依据回归方程和Design-Expert 8.05b软件绘制出不同因素的响应面分析图,结果如图6所示。从响应面分析图上可以较直观地看出影响多糖得率各参数之间的交互作用。

从图6中可以看出,超声温度(C)与乙醇浓度(E)交互作用对多糖得率影响显著,AB、AC和CD三个交互作用较大，其余均不显著(不显著交互作用响应面图未列出)。交互作用不显著的原因可能是因素的主效应在起作用。曲线走势越陡峭,表明该因素对多糖的得率影响越大;曲线走势越平缓说明该因素对多糖得率影响较小[13-15]。研究结果表明,对CAPs得率影响最大的是多糖提取液醇沉时的乙醇浓度,其次是超声时的功率和温度,表3中回归分析结果也与此相吻合,乙醇浓度对CAPs得率影响达到极显著水平(p<0.01),液料比、超声功率和超声温度三者对应的p值均小于0.01,达到了极显著水平。

2.2.3 最佳工艺参数确定及验证实验利用Design-Expert 8.05b软件进行工艺优化处理,得到CAPs最佳提取工艺:液料比29.87∶1,超声时间19.53 min,超声温度80 ℃,超声功率463.91 W,乙醇浓度99.98%,在该条件下,灰灰菜多糖得率可达最大值5.172%。结合生产实践和便于实际操作将各因素取值修正为:液料比30∶1,超声时间20 min,超声温度80 ℃,超声功率460 W,乙醇浓度100%,在此条件下进行六次平行实验,得出CAPs平均得率为5.153%(纯度为82.36%),非常接近模型预测值,说明模型可靠。

2.3CAPs的体外抗氧化活性研究

图6 各因素交互影响多糖得率的响应面图Fig.6 Response surface plot for the mutual effects of five variables on yield of CAPs

2.3.1 CAPs对DPPH自由基的清除作用从图7中可以看出,CAPs对DPPH自由基的清除作用呈现良好的剂量-效应关系,且随着多糖质量浓度的增加而呈现上升趋势,其半数抑制浓度(IC50)为1.899 mg/mL。当浓度从1.0 mg/mL增加到3.0 mg/mL时,CAPs对DPPH自由基的清除率增长较快,而后随着浓度的增加增速有所放缓。当浓度达到4.0 mg/mL时,CAPs对DPPH清除率达到87.4%,接近同浓度的阳性对照。

图7 CAPs对DPPH自由基的清除率Fig.7 Activities of CAPs scavenging DPPH radical

2.3.2 CAPs对ABTS自由基的清除作用由图8可知,随着CAPs浓度的不断增加,其对ABTS自由基的清除率呈现不断上升趋势,其IC50为1.973 mg/mL。当浓度从1.0 mg/mL增加到2.5 mg/mL时,CAPs对ABTS·的清除率几乎呈线性递增,此后增加趋势放缓。当浓度为4.0 mg/mL时,CAPs对ABTS·清除率达到最大为89.9%。此外,从图中可以看出,与相同浓度的阳性对照相比,CAPs对ABTS自由基的清除能力稍低,尤其是在多糖样品浓度较低的情况下,这种差异较明显,这可能是多糖纯度不够高的缘故。

图8 CAPs对ABTS自由基的清除率Fig.8 Activities of CAPs scavenging ABTS radical

图9 CAPs对羟基自由基的清除率Fig.9 Activities of CAPs scavenging hydroxyl radical

2.3.3 CAPs对羟基自由基的清除作用从图9中可以看出,CAPs和阳性对照维生素C(Vit.C)对羟基自由基的清除率均随着样品浓度的不断增大呈逐渐上升的趋势,尤其是当多糖样品浓度从1.5 mg/mL开始,几乎呈现线性递增;而Vit.C的清除率则较高,尤其是当浓度超过1.5 mg/mL时,清除率均在90.0%以上。当样品浓度从0.5 mg/mL增加到4.0 mg/mL时,CAPs对羟基自由基的清除率由5.97%逐渐提高至79.43%,其半数抑制浓度(IC50)为2.827 mg/mL。相比对DPPH·和ABTS·的清除能力,CAPs对羟基自由基的清除能力要差一些。

此外,从图7～图9中可以看出,CAPs对DPPH·和ABTS·的清除活性要强于羟基自由基,这一点通过三者的IC50值也可以得到证实。总体而言,CAPs对DPPH·、ABTS·和·OH均有较好的清除活性,并且呈现良好的剂量-效应关系。

3 结论

探明了超声辅助热水浸提-乙醇沉淀法提取灰灰菜粗多糖最佳工艺,液料比30∶1,超声时间

20 min,超声温度80 ℃,超声功率460 W,乙醇浓度100%,在此条件下多糖得率为5.153%(纯度为82.36%)。

CAPs对DPPH·、ABTS·和·OH均有较强的清除能力,其半数抑制浓度(IC50)分别为1.899、1.973和2.827 mg/mL。当浓度为4.0 mg/mL时,CAPs对DPPH·、ABTS·和·OH的清除率分别为89.9%、87.4%和79.3%,说明CAPs具有较好的体外抗氧化活性。

[1]南京中医药大学. 中药大辞典·下册[M]. 第二版. 上海:上海科学技术出版社,2006,5880-5881.

[2]Pal A,Banerjee B,Banerjee T,et al. Hepatoprotective activity ofChenopodiumalbumLinn. plant against paracetamol-induced hepatic injury in rats[J]. International Journal of Pharmacy & Pharmaceutical Sciences,2011,3(3):55-57.

[3]Jain N K,Singhai A K. Hepatoprotective activity ofChenopodiumalbumLinn:invitroandinvivostudies[J]. Journal of Experimental & Integrative Medicine,2012,2(4):331-336.

[4]徐固华,夏新奎,刘永垒. 灰灰菜抑菌成分提取及其抑菌活性研究[J]. 湖北农业科学,2010,49(11):2802-2803.

[5]李燕,王寒,薛天乐,等. 灰灰菜提取物体外抑菌活性的研究[J]. 食品科学,2009,30(5):112-114.

[6]赵良忠,王放银,段林东. 灰灰菜抗菌物质提取及抗菌效果研究[J]. 生物技术,2004,14(4):66-67.

[7]陈少金. 一种灰灰菜鸡骨泥营养挂面及其制备方法:中国,CN 103222588 A[P]. 2013-07-31.

[8]Poonia A,Upadhayay A.ChenopodiumalbumLinn:review of nutritive value and biological properties[J]. J Food Sci Technol,2015,52(7):3977-3985

[9]田华. 灰灰菜黄酮类化合物的提取及其体外抗氧化性研究[J]. 食品工业,2013,34(9):114-117.

[10]Cutillo F,Dellagreca M,Gionti M,et al. Phenols and lignans fromChenopodiumalbum[J]. Phytochemical Analysis,2006,17(5):344-349.

[11]王彦博,石燕,唐慧安. 超声波提取野生灰灰菜中叶黄素的工艺研究[J]. 中国食品学报,2014,14(3):122-127.

[12]张卫红,吴晓霞,马空军. 超声波技术强化提取天然产物的研究进展[J]. 现代化工,2013,33(7):26-29.

[13]喻俊,王涛,贾春红,等. 响应面优化牛蒡子多糖的提取及其抗氧化活性研究[J]. 食品与发酵工业,2015,41(6):207-212.

[14]兰金荣,叶文斌. 响应面法与正交设计法比较研究天麻多糖提取优化工艺[J]. 包装与食品机械,2014,32(4):10-15.

[15]李堆淑. 超声提取细黄链霉菌胞外多糖工艺与抗氧化活性研究[J]. 食品与发酵工业,2016,42(5):253-258.