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舞花姜根总皂苷的提取工艺及其抗氧化活性

2018-01-22,,,,,*

食品工业科技 2018年1期
关键词:总皂苷提取液皂苷

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(1.贵州省山地环境信息系统与生态环境保护重点实验室/国家喀斯特石漠化防治工程技术研究中心,贵州师范大学,贵州贵阳 550001;2.贵州省药物质量控制及评价技术工程实验室,贵州师范大学,贵州贵阳 550001;3.贵州师范大学天然药物质量控制研究中心,贵州贵阳 550001)

舞花姜(GlobbaracemosaSmith)为姜科舞花姜属多年草本植物,主要分布于四川、贵州、广西、广东、湖南、江西、福建等中国南部及西南部各省,在贵州主要分布在绥阳县、三都县、都匀市、务川县、锦屏县、黎平县、台江县、江口县、荔波县、凯里市和三穗县等地,主要生长在山谷密林的沟边或潮湿的河边[1-2],其性味气微、味淡、微甘[3]。据文献报道,舞花姜的根与果实在民间均有药用历史,它具有健胃,消炎功效,主要用于治疗胃炎、消化不良、急慢性肾炎等[4]。

目前对舞花姜的研究主要集中于化学成分的分析[5],主要有木栓酮、β谷甾醇、半乳糖醇、3-羟基-豆甾-5-烯-7-酮、豆甾-5-烯-7-酮、α-蒎烯、β-蒎烯、芳樟醇、γ-松油烯、莰烯、橙花叔醇、柠檬烯、乙酸龙脑酯等多种有效成分。其中,木栓酮属于五环三萜类化合物,已有研究证实木栓酮有抗肿瘤活性,同时也可作为一种化疗药物,治疗肿瘤性疾病[6];α-蒎烯还有抗肿瘤、抗真菌、抗过敏及改善溃疡的功效[7];β-蒎烯有较强的抗炎,祛痰和抗真菌作用[8]。芳樟醇除了可用作食用香精以及工业生产中的重要中间体,还具有镇痛、抗焦虑、镇静睡眠、抗炎、抗肿瘤、抗菌等药理活性[9];乙酸龙脑酯具有镇痛抗炎等药理作用[10-11]。因此,舞花姜作为一种药用历史的草本植物,具有潜在的药用价值和开发前景。但目前,对于舞花姜根总皂苷的提取工艺及其抗氧化活性研究的报道尚未发现。本实验采用响应面法优化舞花姜根总皂苷的最佳提取工艺[12-13],并用 DPPH和ABTS研究舞花姜根总皂苷的抗氧化活性,同时测定了13个不同产地的舞花姜根总皂苷含量及抗氧化活性,为舞花姜药材的开发利用及质量评价提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

供试品 采集于贵州的13个县市,经贵阳中医学院孙庆文教授鉴定为姜科舞花姜属舞花姜GlobbaracemosaSmith的全草。将采集的新鲜舞花姜样品,将其根、茎、叶分离并阴干;齐墩果酸对照品 批号为GZDD-0043,贵州迪大生物有限公司;DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼) 批号为217-591-8,日本东京化成工业株式会社;ABTS(2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐) 批号为30931-67-0,北京百灵威科技有限公司;无水乙醇、甲醇、正丁醇、高氯酸、冰醋酸、香草醛等 均为分析纯。

Spectra Max Plus 384酶标仪 美国Molecular Device公司;XS 105十万分之一分析天平、AL 204万分之一分析天平 梅特勒-托利多仪器上海有限公司;DFY-200高速万能粉碎机 温岭市林大机械有限公司;R-200旋转蒸发仪 瑞士BUCHI公司;电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司;Eppendorf research plus微量移液器 德国Eppendorf 公司;TD5M低速离心机 长沙迈佳森仪器设备有限公司。

1.2实验方法

1.2.1 舞花姜根总皂苷的提取方法 准确称取舞花姜根样品1.00 g,加料液比为1∶25 (g/mL)的甲醇溶液,超声提取50 min,过滤,离心,取上清液10 mL,挥干甲醇,用20 mL水溶解,再用水饱和的正丁醇萃取2次(每次20 mL),弃去水液,合并正丁醇液后挥干,残渣用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中,作为舞花姜根提取液。

1.2.2 标准曲线的绘制 准确称取一定量的齐墩果酸对照品,用甲醇配制成0.1836 mg/mL的标准溶液。分别吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1 mL对照品溶液于具塞试管中,挥干溶剂,分别加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸,再加入0.8 mL高氯酸,摇匀后,在75 ℃水浴锅中显色,25 min后迅速取出放入冰水中,冷却至室温取出,加入5 mL冰醋酸,摇匀,用同样方法设置甲醇空白为参比,各平行三份。在550 nm处测定吸光度(A550 nm),以对照品溶液的浓度(mg/mL)为横坐标,吸光度A为纵坐标,绘制齐墩果酸标准曲线,计算回归方程。

1.2.3 最大吸收波长的确定 分别吸取一定量的样品溶液及对照品溶液,按1.2.2项下的显色方法进行操作,操作完毕后利用酶标仪在400~700 nm波长下进行全波长扫描,以确定提取液的最大吸收波长。

1.2.4 总皂苷的含量测定 准确吸取0.6 mL舞花姜根提取液溶液于10 mL具塞试管中,在70 ℃恒温水浴锅上蒸干,按1.2.2项下的显色方法进行显色,显色完毕后将混合溶液引入一个ELISA板,于550 nm波长处测定样品的吸光度(A550 nm),各平行三份,用同样方法设置甲醇空白为参比,采用齐墩果酸为对照品,根据所得标准曲线算出舞花姜根提取液的总皂苷含量,单位为:mg/g。

式中:C1为对照品齐墩果酸的浓度(mg/mL);A2为样品的吸光度;n为供试品溶液的稀释倍数;V为样品溶液加入量的体积(mL);M为舞花姜根粉末质量(g);A1为对照品的吸光度。

1.2.5 舞花姜根总皂苷的提取的单因素实验 采用1.2.1项下的方法提取舞花姜根总皂苷,以舞花姜根总皂苷含量为指标,分别以不同的甲醇浓度、料液比、样品粒度、超声功率、超声时间、提取次数作为单因素,考察各因素对舞花姜根总皂苷含量的影响,每组实验重复三次。

1.2.5.1 甲醇浓度的影响 在料液比1∶25 (g/mL),超声时间50 min,提取1次,超声功率300 W,样品粒度40目条件下,探讨甲醇浓度(20%、40%、60%、80%、100%)对舞花姜根总皂苷含量的影响。

1.2.5.2 料液比的影响 在超声时间50 min,提取1次,超声功率300 W,甲醇浓度100%,样品粒度40目条件下,探讨料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)对舞花姜根总皂苷含量的影响。

1.2.5.3 样品粒度的影响 在料液比1∶25 (g/mL),超声时间50 min,提取1次,超声功率300 W,甲醇浓度100%条件下,探讨样品粒度(20、40、60、80、100目)对舞花姜根总皂苷含量的影响。

1.2.5.4 超声功率的影响 在料液比1∶25 (g/mL),超声时间50 min,提取1次,甲醇浓度100%,样品粒度40目条件下,探讨超声功率(120、180、240、300 W)对舞花姜根总皂苷含量的影响。

1.2.5.5 超声时间的影响 在料液比1∶25 (g/mL),提取1次,超声功率300W,甲醇浓度100%,样品粒度40目条件下,探讨超声时间(20、30、40、50、60 min)对舞花姜根总皂苷含量的影响。

1.2.5.6 提取次数的影响 在料液比1∶25 (g/mL),超声时间50 min,超声功率300W,甲醇浓度100%,样品粒度40目条件下,探讨提取次数(1、2、3次)对舞花姜根总皂苷含量的影响。

1.2.6 响应面优化实验设计 在单因素实验基础上,利用响应面分析法进行提取工艺条件的优化[14],选取料液比(A)、样品粒度(B)和超声提取时间(C)三个因素作为自变量,以总皂苷的含量作为响应值(Y)。根据 Box-Behnken Design(BBD)实验设计原理制定因素水平表(见表1)。

表1 响应面设计因素水平表Table 1 Variables and levels in the response surface design

1.2.7 舞花姜根总皂苷抗氧化活性研究

1.2.7.1 VC对照品溶液的制备 准确称取VC对照品10.01 mg,用水溶解定容到10 mL容量瓶中,配制成1.01 mg/mL的样品液。

1.2.7.2 ABTS+·自由基清除能力的测定方法 实验测定方法参照文献[15-16]并略作修改,具体为:准确称取ABTS 19.25 mg和K2S2O733.50 mg,分别用无水乙醇和蒸馏水溶解,定容到25 mL容量瓶中,使ABTS+·和K2S2O7最后浓度分别为0.77 mg/mL和1.34 mg/mL,按1∶1比例混合,在室温避光条件下放置12 h,形成ABTS+·储备液。使用无水乙醇将储备液ABTS+·稀释,使其在734 nm处的吸光度值为0.80±0.02。取0.6 mL ABTS+·溶液加入到0.2 mL不同浓度的样品溶液中,摇匀,在室温下放置7 min。将混合溶液引入一个ELISA板,VC作为空白对照,于734 nm波长处测定吸光度(A734 nm),各平行三份。将以上测得数据代入下列公式计算ABTS+·自由基清除率。

SA(清除率,%)=[1-(A样品- A空白)/A对照]× 100

式中:A样品:样品溶液与ABTS+·溶液反应的吸光度值;A对照:甲醇与ABTS+·的吸光度值;A空白:甲醇与样品溶液的吸光度值。

1.2.7.3 不同产地舞花姜根提取液对ABTS+·自由基清除能力的测定 取0.6 mL ABTS+·溶液加入到0.2 mL一定浓度的舞花姜根提取液中,摇匀,在室温下放置7 min。将混合溶液引入一个ELISA板,VC作为空白对照,于734 nm波长处测定吸光度(A734 nm),各平行三份,按1.2.7.2项下的方法计算舞花姜根总皂苷对ABTS+·自由基清除率。

1.2.7.4 DPPH自由基清除能力的测定方法 参照文献[17-19]并略作修改,具体为:准确称取 DPPH 10.50 mg,用无水乙醇定容于100 mL容量瓶,配制0.105 mg/mL的溶液。取0.4 mL不同浓度的样品溶液与0.4 mL 0.105 mg/mL DPPH工作液混合,室温下反应40 min后,将混合溶液引入一个ELISA板,VC作为空白对照,在517 nm处测定吸光度值(A517 nm),各平行三份,将以上测得数据代入下列公式计算DPPH自由基清除率。

SA(清除率,%)=[1-(A样品-A空白)/A对照]× 100

式中:A样品:样品溶液与DPPH溶液反应的吸光度值;A对照:甲醇与DPPH溶液的吸光度值;A空白:甲醇与样品溶液的吸光度值。

1.2.7.5 不同产地舞花姜根提取液对DPPH自由基清除能力的测定 取一定浓度的舞花姜根提取液与0.4 mL 0.105 mg/mL DPPH工作液混合,室温下反应40 min后,将混合溶液引入一个ELISA板,VC作为空白对照,在517 nm处测定吸光度值(A517 nm),各平行三份,按1.2.7.4项下的方法计算舞花姜根总皂苷对DPPH自由基清除率。

1.3数据统计分析

利用Design-Expert 8.0.6软件分析及Microsoft Excel(Office 2016)程序对实验结果进行分析。

2 结果与分析

2.1标准曲线的绘制

以齐墩果酸标准溶液浓度(mg/mL)为横坐标,其吸光度A为纵坐标,绘制标准曲线,计算得齐墩果酸标准曲线回归方程为:y=20.111X+0.0448,R2=0.9994(n=8),对照品在0.0061~0.0336 mg/mL浓度范围内与吸光度呈现良好的线性关系。

2.2最大吸收波长的确定

舞花姜根提取液和齐墩果酸对照品溶液的最大吸收波长如图1和图2所示,结果可知,齐墩果酸对照品溶液和舞花姜根提取液在550 nm处均有最大吸收,故确定550 nm为最大吸收波长。

图1 齐墩果酸紫外-可见吸收光谱图Fig.1 UV-Visible Spectrum of the oleanolic acid

图2 样品溶液紫外-可见吸收光谱图Fig.2 UV-visible spectrum of the sample solution

2.3单因素实验结果与分析

2.3.1 甲醇浓度的影响 结果如图3所示,随着甲醇浓度的增加,提取总皂苷含量也在增大,当甲醇浓度为100%时,提取效果最好。这可能由于舞花姜根的主要成分是萜类和甾体皂苷元类物质,极性较小,较低浓度的甲醇极性太大,不利于总皂苷的溶出。故选用100%的甲醇做提取溶剂。

图3 溶剂浓度的考察Fig.3 The study of solvent concentration

2.3.2 料液比的影响 结果如图4所示,随着料液比从1∶10到1∶30 g/mL 时,总皂苷含量呈现先下降后上升的趋势,但从1∶25到1∶30 g/mL 时,总皂苷含量呈现下降趋势。这可能是由于在一定范围内增加提取液的体积可以增加接触面积,使得更多的总皂苷被提取出来,但是提取液的体积继续增大会使总皂苷的提取达到饱和,同时提取液的挥发量会增大,导致提取量趋于平稳或降低。考虑到提取溶剂体积过大会增加成本,体积过小总皂苷提取不完全,导致原料浪费,故选择1∶25 (g/mL)作为提取舞花姜根总皂苷的最佳料液比。因此,在Box-Behnken软件设计中选择1∶20、1∶25、1∶30 g/mL进行响应面实验。

图4 不同料液比的考察Fig.4 The study of different solid-liquid ratio

2.3.3 样品粒度的影响 物料的粒度大小要适当,声波在穿透过程中,能量会随着穿透距离的增大而发生衰减,如果粒度过大,料层过厚,会使物料粒子能量吸收不均,作用效果不均衡,可能会导致得率降低。结果如图5所示,原料粒径的大小对总皂苷的影响明显,随着粒径的减小,总皂苷含量先增大后减小,在40目时达到最高。这是因为随着粒径逐渐减小,杂质逐渐被分出,原料可以和溶剂充分混合,使得总皂苷含量明显增加,但是粒径进一步减小,提取液粘度增加,不利于总皂苷的溶出。在40目时提取效果最好,总皂苷含量最大。因此,在Box-Behnken软件设计中选择20、40、60目进行响应面实验。

图5 样品粒度的考察Fig.5 The study of the particle sizes of sample

2.3.4 超声功率的影响 结果如图6所示,随着功率的增大,样品总皂苷含量出现交替上升,在功率为300 W时,提取的总皂苷的含量最大。这是因为功率不断增大加大植物细胞内部的温度,分子热运动加快,有利于总皂苷的提取。故选择300 W为本实验的提取功率。

图6 提取功率的考察Fig.6 The study of extracting power

2.3.5 超声时间的影响 结果如图7所示,在提取时间从20到50 min之间时,提取样品的总皂苷含量逐渐上升,在50 min时,超声提取样品的总皂苷含量最大,但50 min过后,总皂苷含量呈现迅速下降。这可能是因长时间的超声提取溶剂挥发或总皂苷受温度的影响部分分解所致,所以超时提取时间不宜过长,故50 min为最佳提取时间。因此,在Box-Behnken软件设计中选择40、50、60 min进行响应面实验。

图7 超声提取时间的考察Fig.7 The study of ultrasonic extraction time

2.3.6 超声次数的影响 结果如图8所示,随着提取次数的增加,提取的总皂苷量也随之增加,当总提取次数在2~3次范围时,舞花姜根总皂苷含量曲线基本趋于平坦,无显著性差异,所以为了从节省资源、降低能耗、成本等角度考虑,故选择提取次数为2次。

图8 超声提取次数的考察Fig.8 The study of ultrasonic extraction times

2.4响应面实验结果与分析

在单因素实验结果的基础上,根据Box-Benhnken设计原理,以料液比(A)、样品粒度(B)和超声提取时间(C)3个因素为自变量,舞花姜根总皂苷含量为响应值,采用响应面法进行三因素三水平的响应面分析,研究各因素对舞花姜根总皂苷含量影响的显著性和各因素的最佳组合,一共包括17组实验方案,实验设计方案及实验结果见表2。

表3 响应面二次回归模型与回归系数方差分析结果Table 3 Significance test results for the coefficients of quadratic polynomial regression models

注:* 表示显著水平(p<0.05);** 表示极显著水平(p<0.01)。

表2 响应面实验设计与结果Table 2 Response surface Box-Behnken designarrangement and experimental results

2.4.1 方差分析及二次多元回归模型的拟合 结合表2结果,利用 Design-Expert 8.0.6统计软件对表 2数据进行多项式回归分析,得到舞花姜根总皂苷含量 Y对单因素料液比(A)、样品粒度(B)和超声提取时间(C)的相应的二次方程模型。Y=10.63+0.99A+0.38B+0.36C-0.23AB-0.15AC-0.37BC-0.95A2-2.16B2-1.56C2。

对上述回归模型进行方差分析,并对模型系数进行显著性检验,结果见表3。该回归方程描述各因素与响应值之间的关系时,因变量和所有自变量之间的线性关系显著,回归模型的相关系数R2=0.9776,p<0.01,表示回归模型高度显著;失拟项p=0.2998>0.05不显著,说明该回归模型能够很好的拟合实验结果。R2=0.9776,说明总皂苷含量的变化有97.76%是由提取因素造成。因此,该回归方程可以很好地反映舞花姜根总皂苷含量与提取因素之间的真实关系,即可通过该方程确定最优提取工艺条件。从回归模型系数显著性检验结果中可以看出,模型中一次项A、B、C均极显著,其中A,B最为显著,表明在所选因素中料液比(A)、样品粒度(B)对舞花姜根总皂苷含量影响最大;交互作用AB、BC极显著,AC交互作用显著,二次项系数A2、B2、C2也极显著。在所选取的各因素水平范围内,A、B、C这三因素对舞花姜根总皂苷的含量影响最大的是料液比和样品粒度,其次是超声提取时间。

图9 料液比、超声提取时间和样品粒度对总皂苷含量交互影响的响应面图和等高线图Fig.9 Response surface and contour plots of the ratio of liquid to material,ultrasonic extraction time and particle sizes of sample to total saponins content

2.4.2 各因素交互作用的响应面分析 图9分别为料液比(A)、样品粒度(B)和超声提取时间(C)三因素交互作用对舞花姜根总皂苷含量的响应曲面图。当超声提取时间一定时,料液比,样品粒度对舞花姜根总皂苷含量的交互影响如A图所示。可以看出,当料液比一定时,随着样品粒度的增加,总皂苷含量呈现先增加后降低的趋势。当样品粒度低于约40目时,总皂苷的含量随着样品目数的增大而增大;而当样品粒度一定时,总皂苷含量也有显著的变化,也呈现先增加后降低的趋势。当样品粒度一定时,提取时间与料液比对舞花姜根总苷含量的交互影响如C图所示。可以看出,当料液比一定时,随着提取时间的增加,总皂苷含量先增后减;当提取时间一定时,总皂苷含量随着料液比的增大呈先增后缓慢下降的趋势;当料液比一定时,样品粒度与提取时间对舞花姜根总皂苷含量的交互影响如E图所示。可以看出,样品粒度一定时,随着提取时间的增加,舞花姜根总皂苷含量呈现上升趋势,在50 min附近达到最大值后下降;当提取时间一定时,总皂苷含量随样品粒度的增大先增加后降低。因此表明,在一定程度上增加样品粒度并控制提取时间约50 min,能够提高总皂苷含量。

2.4.3 最佳工艺参数的确定与模型验证 通过舞花姜根总皂苷含量的二次多项数学模型由软件分析得到舞花姜根总皂苷的最佳提取工艺条件为:料液比为1∶27.62 (g/mL),样品粒度37.5目,提取时间51.05 min,总皂苷含量为10.93 mg/g。考虑操作的可行性,对最佳提取条件进行修正,料液比为1∶30 (g/mL),样品粒度40目,超声提取时间51 min,采用修正后的条件对所建模型进行验证实验,结果显示舞花姜根总皂苷含量为10.88 mg/g(n=3),RSD为0.45%,证明利用响应面分析法得到的舞花姜根总皂苷含量的提取工艺参数真实可靠,具有实用价值。

2.5舞花姜根总皂苷的抗氧化活性研究

2.5.1 ABTS+·自由基清除能力的测定 从图10可知,当舞花姜根提取液浓度在2.25~22.25 mg/mL之间时,ABTS+·自由基的清除率与舞花姜根提取液的质量浓度呈现正相关关系,当样品浓度为22.25 mg/mL时,舞花姜根提取液对ABTS+·自由基清除率为48.97%±0.62%。

图10 舞花姜根提取物对ABTS自由基的清除能力Fig.10 The scavenging ability of Globba racemosaSmith roots extract on ABTS free radical

2.5.2 不同产地舞花姜根提取物对ABTS+·自由基清除能力的测定 由图11可知,不同产地舞花姜根的总皂苷含量越高,相应的对ABTS+·自由基的清除能力越强,说明了舞花姜根提取物对ABTS+·自由基的清除能力与总皂苷的含量成正比关系。

图11 不同产地舞花姜根提取物对ABTS自由基的清除能力和总皂苷含量关系Fig.11 Relationship between scavenging ability ofGlobba racemosa Smith roots extract from differenthabitats ABTS free radicaland total saponins content

2.5.3 DPPH自由基清除能力的测定 由图12可知当舞花姜根提取液浓度在2.25~22.25 mg/mL之间时,DPPH自由基的清除率与舞花姜根提取液的质量浓度呈现正相关关系,当样品浓度为22.25 mg/mL时,舞花姜根提取液对DPPH自由基的清除率为73.02%±1.59%。

图12 舞花姜根提取物对DPPH自由基的清除能力Fig.12 The scavenging ability of Globba racemosa Smithroots extract on DPPH free radical

2.5.4 不同产地舞花姜根提取物对DPPH自由基清除能力的测定 由图13可知,不同产地舞花姜根的总皂苷含量越高,相应的对DPPH自由基的清除能力越强,说明了舞花姜根提取物对DPPH自由基的清除能力与总皂苷的含量成正比关系。

图13 不同产地舞花姜根提取物对DPPH自由基的清除能力和总皂苷含量关系Fig.13 Relationship between scavenging ability ofGlobba racemosa Smith roots extract from differenthabitats DPPH free radicaland total saponins content

2.6不同产地舞花姜根总皂苷含量测定

在最佳提取条件下,于550 nm波长处测定吸光度值,以相应的提取溶剂作为参比,测定13个不同产地,不同采摘期舞花姜根总皂苷含量,具体见表4。

从表4中可以看出,各产地样品总皂苷含量在4.73~16.92 mg/g之间。来自三都县和天柱县的含量较高,尤其以三都县的含量最高,达到16.92 mg/g,来自贵州荔波县的含量最低,只有4.73 mg/g,可以从表中明显地看出不同产地的样品总皂苷含量存在较大差异。

3 结论

本研究结果表明,各单因素对舞花姜根总皂苷的含量影响最大的是料液比和样品粒度,其次是超声提取时间;交互影响中,样品粒度和提取时间的交互作用较明显;根据回归方程得到最佳提取工艺为:超声功率300 W、超声提取时间51 min、样品粒度40目、甲醇浓度100%、料液比1∶30 (g/mL)、提取2次。在此条件下,舞花姜根总皂苷含量可达10.88 mg/g,RSD为0.45%。所优化的提取条件稳定可靠,简单快捷,可用于舞花姜根总皂苷含量的测定,这为舞花姜药材的质量控制和深度开发与利用提供了一定的科学依据。

本实验采用DPPH自由基清除能力和ABTS+·自由基清除能力并研究其抗氧化活性。结果可知,在一定范围内,样品的浓度与其抗氧化能力呈正相关,同时也比较了不同产地的舞花姜根总皂苷含量及总皂苷含量对DPPH自由基和ABTS+·自由基的清除能力,得出不同产地的样品总皂苷含量存在较大差异且表现出不同程度的抗氧化活性,且抗氧化活性与舞花姜根中总皂苷含量成正比关系,验证了其抗氧化能力与总皂苷含量有关。

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