牛栏山二锅头酿造过程中的真菌多样性分析

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(1.北京顺鑫农业股份有限公司牛栏山酒厂,北京 101301;2.中国科学院微生物研究所,真菌学国家重点实验室,北京 100101)

清香型白酒是我国最古老的酒种之一,具有清香纯正,醇甜柔和,自然谐调,余味爽净的特点[1]。牛栏山二锅头属于清香型白酒,其酿造过程是开放式的多菌种固态发酵方式,以高梁等谷物为原料,大曲为糖化发酵剂,采用清蒸清茬酿造工艺、固态地缸发酵、清蒸流酒[2]。开放式的酿造过程有助于其网罗自然界的多种微生物,这些微生物在酿造过程中繁衍、代谢,形成了属于牛栏山二锅头的独特风味。

真菌类微生物是白酒酿造中不可或缺的一类微生物,其在酿造过程中主要可分为丝状真菌和酵母菌两大类。目前普遍认为,丝状真菌是酿酒生产前期发酵原料中所含有的淀粉等大分子物质降解的主要动力,其分解后的产物可被其他微生物所利用,对产酒、产香存在促进作用,同时丝状真菌在生长代谢过程中会生成一些呈香物质,对风味的形成做出贡献[3-5]。酵母菌则被认为是发酵前期产酒、生香的主力菌,在发酵过程中,酵母菌可以产生酒化酶作用于葡萄糖,通过糖酵解和丙酮酸无氧降解过程生成乙醇,其所分泌的酯化酶又能利用酒醅环境中的乙醇、酸等底物通过酯化过程合成多种风味物质[6-9]。可以看出,真菌微生物在白酒发酵中涵盖了糖化、产酒、生香这几个重要过程,所以对白酒酿造中真菌微生物进行研究有助于我们系统的解析白酒酿造过程。

传统微生物分离是白酒微生物研究中较为常用的技术手段,它主要适用于发酵中可培养类微生物,可以有效地确定微生物的变化规律并获得活体菌株。高通量测序技术可以对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析,可以快捷方便的读取样品中复杂的微生物结构,具有明显的先进性和优势,是分析复杂多菌种样品的首选方法[10]。目前,高通量测序技术已经运用于各种分子生物学领域,包括人体微生物研究方面、水中生物、土壤微生物群落研究等[11-12]。

本文利用传统微生物分离方法和高通量测序技术,分析了牛栏山二锅头发酵过程中真菌的演替规律。将两种方法结果相结合,确定了发酵过程中真菌的变化规律及优势微生物,为清香型白酒优良真菌微生物的筛选及其功能性研究提供指导。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

冬季大茬发酵酒醅(第一次入缸发酵的高粱) 牛栏山酒厂;氯仿、异戊醇、异丙醇均为分析纯 购于上海生工生物工程有限公司;YPD培养基:酵母浸粉10 g,蛋白胨20 g,葡萄糖20 g,琼脂20 g,水1 L;PDA培养基:马铃薯浸提液500 mL,葡萄糖20 g,琼脂20 g,水500 mL;孟加拉红培养基、察氏培养基 北京奥博星生物技术有限公司;FastDNA SPIN Kit for Soil(MP bio土壤基因组DNA提取试剂盒) 北京比特博生物技术有限公司。

BSC-1100ⅡA2型生物安全柜 北京东联哈尔仪器制造有限公司;快速梯度基因扩增仪(梯度C1000)、基础型水平电泳仪 美国BIORAD公司;全自动凝胶成像仪 美国BIORAD公司;1-14k高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司;SPX-320型生化培养箱 宁波江南;DW-86L828W冷水之星 海尔超低温冰箱;样品快速制备系统 美国MP FastPrep-24。

1.2实验方法

1.2.1 发酵酒醅真菌分离 取样:根据大茬发酵温度曲线特点,从整个发酵周期28 d中确定七个时间点采集样品,分别为0、3、7、13、19、23、28 d,选取同批次发酵的三缸作为取样缸(平行对照),取样位置为地缸中心点距地缸表面60 cm处,样品编号为D3A、D3B、D3C其余取样点以此类推(入池0 d初始样品,只取一份即可)。

分离:称取发酵酒醅样品10 g于90 mL无菌水稀释,拟定为10-1梯度。依次稀释为10-2、10-3、10-4、10-5梯度,分别吸取10-3、10-4、10-5梯度稀释液0.1 mL,涂布于相应分离筛选培养基平板上。

培养:将涂布分离好的平皿按照常规培养法培养,培养的微生物包括丝状真菌、酵母菌。培养温度分别为丝状真菌30 ℃、酵母28 ℃,培养时间根据菌落的生长情况而定,一般为24～48 h[13]。

计数及挑菌:根据选择培养的结果,酵母菌以10-4板,丝状真菌以10-3板为主计数。根据丝状真菌和酵母菌形态差异,将不同形态真菌分类别单独挑取计数[14-15],采用PCR随机鉴定20～30株,确定该类别酵母准确分类,并根据稀释倍数计算不同微生物的种群数量。其余梯度每个平板挑取不同形态的单菌落,接种在斜面上28 ℃培养2 d,挑取新鲜的纯菌接种至20%无菌甘油管-80 ℃超低温冰箱保藏。

1.2.2 真菌PCR扩增及测序

1.2.2.1 酵母DNA提取方法 接取少量活化的菌体,于1.5 mL离心管内;加入100 μL裂解液(100 mmol/L Tris,30 mmol/L EDTA,0.5% SDS,pH8.0,115 ℃灭菌30 min备用);100 ℃水浴15 min;加入100 μL 2.5 mol/L的醋酸钾溶液,冰浴60 min;4 ℃下12000×g离心5 min,取上清液200 μL至0.5 mL离心管中;加入等体积的氯仿-异戊醇(24∶1),剧烈振荡10 min,12000×g离心15 min,移取100 μL上清液至0.5 mL离心管中;加入100 μL预冷的异丙醇,混匀后-20 ℃下放置20 min;12000×g离心15 min,弃去上清;用70%的酒精洗涤沉淀两次;沉淀过夜自然干燥;加入50 μL已灭菌的超纯水,室温下溶解1 h,-20 ℃冰箱储藏备用[16-17]。

1.2.2.2 丝状真菌DNA提取方法 采用土壤基因组DNA提取试剂盒FastDNA SPIN Kit for SoiL试剂盒提取。

1.2.2.3 PCR扩增及鉴定 对所提取的真菌DNA进行26S rDNA D1/D2区和ITS区片段扩增,酵母菌采用通用引物NL1/NL4,丝状真菌采用通用引物ITS5/ITS4,如表1所示。

PCR反应条件:94 ℃加热3 min使模板DNA变性,然后进入下列温度循环:94 ℃变性30 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,共进行35个循环,最后在72 ℃延伸5 min。

PCR产物送公司测序后,用Chromas软件分析测序质量,去除峰图不可靠的部分对DNA序列进行手动校正,用校正后的序列在NCBI(http://www.ncbi.nLm.nih.gov/bLast)中进行同源序列搜索。

表1 真菌PCR引物序列Table 1 PCR primer sequence of fungi

1.2.3 大茬发酵酒醅高通量测序 称取1 g不同发酵期酒醅样品,经Fastprep处理后,采用土壤基因组DNA提取试剂盒(FastDNA SPIN Kit for SoiL)提取总NDA。浓度检测合格后,送北京奥维森公司对真菌Its1-Its2区行高通量测序,利用Illumina MiSeq PE300进行高通量测序得到原始测序序列,通过Fastqc进行质量检测去除低质量Reads(过滤标准:Q20≥ 90%)。通过Cope软件(Connecting Overlapped Pair-End,V1.2.3.3),进行序列拼接及过滤后利用Mothur软件以平均邻近聚类算法(Average Neighbor Clustering Algorithm)在0.03(或97%的相似度)水平下对Clean Tags进行OTU(OperationaL Taxonomic Units)的聚类,统计各个样品每个OTU中的丰度信息。选取分析数据中每个OTU中一个有代表性的序列,通过BLast比对,获得每一个OTU种名。将OTU按Reads数进行降序排列,选取数量前8 的OTU进行数据分析[18-19]。

2 结果与分析

2.1大茬发酵温度曲线

从图1可以看出大茬发酵温度曲线呈现前缓升、中挺、后缓落的趋势,是清香型白酒较为理想的升温曲线,即发酵升温应逐步上升,至主发酵期,温度应稳定一个时期,随后进入后发酵期,发酵温度缓慢下降,直至出缸蒸馏[20]。发酵的0～9 d属于温度缓升期,缓慢升温有利于控制酒醅生酸,维持正常发酵的进行;9～13 d属于中挺阶段,是主发酵期和后发酵期的交接期;13～28 d为后缓落期,该阶段酒精发酵基本结束主要以产香为主[21]。本研究选取的7个取样点分别涵盖了发酵的3个阶段,对整个发酵过程具有较好的代表性。

图1 大茬发酵温度及取样点Fig.1 Fermentation temperature and sampling point of fermented grains

2.2大茬发酵真菌数量变化规律

本实验中,根据真菌形态和PCR分类结果将发酵过程中真菌分为4大类,分别为:扣囊覆膜酵母、酿酒酵母、生香酵母(扣囊覆膜酵母和酿酒酵母之外的酵母菌)和丝状真菌。通过图2可以看出,在大茬发酵过程中,入池阶段主要真菌是扣囊覆膜酵母和丝状真菌,这两类真菌在发酵前期数量较多,在7 d后数量开始减少,在13 d已经很难分离到;生香酵母在入池阶段无法分离到,随着发酵的进行数量开始快速增长,在发酵第7 d,数量达到顶峰(1.63 log cfu/g),随后数量开始减少,在13 d后已经分离不到;酿酒酵母同样在入池阶段无法分离到,随后开始快速增长,在13 d数量达到顶峰(7.55 log cfu/g),此时扣囊覆膜酵母、丝状真菌和生香酵母在酒醅中已无法分离到,在发酵后期酿酒酵母数量出现下降趋势,但在出池阶段仍保持在5.5 log cfu/g;整体看来,酿酒酵母是大茬发酵中期和后期的主要真菌。

图2 大茬发酵真菌数量变化Fig.2 Quantity changes of fungi in Dacha fermentation

2.3大茬发酵生香酵母和丝状真菌种类变化图

生香酵母在发酵过程中主要活跃在0～7 d,在入池阶段和13 d无法分离到。在本次实验中共分离到478株生香酵母,共分为10个种。通过图3可以看出在生香酵母最为活跃的阶段,主要种类是由毕赤类酵母组成,包括:Pichiakudriavzevii、Pichiafermentans、Pichiafarinosa,同时还含有一定量的TorulasporadeLbrueckii、Candidahumilis、Kazachstaniaservazzii及Wickerhamomycesanomalus,其余种类酵母相对较少。

图3 大茬发酵生香酵母Fig.3 Aroma-producing yeasts of Dacha fermentation

由于丝状真菌只存在发酵前期,且难以通过肉眼判断其种类,所以将发酵前期所分离到的丝状真菌共同分析。从0 d和7 d样品中共分离到丝状真菌5个种,共81株。其中Lichtheimiacorymbifera62株。其余Rhizopusarrhizus和Mucorcircinelloides等数量较少。可以看出L.corymbifera是发酵过程中主要丝状真菌。

表2 大茬发酵丝状真菌Table 2 Filamentous fungi of Dacha fermentation

2.4大茬酒醅高通量测序结果

本次高通量实验中,共获得143种真菌OTU,主要包括酵母目、毛霉目、散囊菌目和丝孢酵母目,挑选Reads数前8的OTU进行数据分析,分别为S.fibuligera、S.cerevisiae、Naumovozymacastellii、K.servazzii、C.humilis、P.kudriavzevii、Candidatropicalis和L.corymbifera。

如图4所得,在0 d入池阶段,上述8种真菌均能在酒醅中检测到,其中S.fibuligera和P.kudriavzevii是主要真菌;在第3 d,S.fibuligera所占比例继续增加,成为了酒醅中的主体真菌;第7 d,S.cerevisiae、Naumovozymacastellii、K.servazzii和C.humilis数量出现增长,S.fibuligera所占比例虽有下降,但仍为酒醅内主体真菌;随着发酵的进行,在13 d顶火期S.fibuligera快速下降,S.cerevisiae成为发酵中的主体真菌,K.servazzii和C.humilis变化不大;在随后19～28 d,虽然S.fibuligera、N.castellii和C.humilis数量稍有增长,但S.cerevisiae继续保持较高的数量关系至出池,是顶火后期的主要真菌。

图4 基于高通量测序结果的大茬酒醅真菌物种多样性和演替Fig.4 Fungal diversity and succession in Dacha fermentation process based on high throughput sequencing of ITS libraries注：A、B、C分别表示同一取样点平行样品。

通过以上结果可以得出,酒醅发酵的0～7 d是温度缓升阶段,酒醅内真菌多样性较为丰富,传统分离方法表明该阶段主要真菌包括S.fibuligera、S.cerevisiae、丝状真菌类的L.corymbifera、R.arrhizus和生香酵母类的P.kudriavzevii、P.fermentans、P.farinosa,虽然生香酵母和S.cerevisiae在0 d后快速增长,但该阶段的主体真菌为S.fibuligera和L.corymbifera。高通量测序结果同样表明了S.fibuligera是发酵前期的主体真菌。在13 d顶火期～28 d发酵结束阶段,传统分离和高通量测序均表明S.cerevisiae为该阶段的主体真菌。两种分析手段共同确定了S.fibuligera和S.cerevisiae是牛栏山二锅头发酵前期和中后期的主要真菌,但在其余真菌数量关系上存在一定差异,如:传统分离结果表明L.corymbifera同样是发酵前期的主要真菌,而高通量测序结果中L.corymbifera在发酵前期所占比例较低;在发酵中后期,酒醅内已难以分离到S.cerevisiae以外的酵母,而高通量测序结果则依然表明在该阶段酒醅中含有一定量的S.fibuligera、N.castellii和C.humilis。分析认为,在发酵过程中,酵母死亡后未降解DNA影响了高通量测序的比例关系,造成了传统分离结果与高通量测序出现差异现象。

3 结论与讨论

本文采用传统分离方法结合26S rDNA D1/D2区和ITS区基因序列分析方法和高通量测序技术共同分析了牛栏山二锅头大茬发酵不同时期真菌多样性组成。研究结果表明,发酵前期升温阶段是酒醅真菌多样性较为丰富的时期,主要为S.fibuligera、S.cerevisiae和以L.corymbifera为主的丝状真菌及以毕赤酵母为主的生香酵母,其中S.fibuligera和L.corymbifera是主体真菌,在发酵中期和后期,酒醅内已很难分离到除S.cerevisiae以外的真菌,S.cerevisiae则成为发酵后期的主体真菌。

本研究利用传统分离技术结合高通量测序技术共同对大茬发酵真菌多样性进行系统研究,有效的弥补了两种分析方法的不足,如传统的分离方法虽然可从酒醅中分离到活体微生物,但培养基的配制较难模拟出酒醅整体环境的复杂性,无法获得准确微生物多样性,而分子生态学技术仅集中于微生物结构的分析,虽然能够全面地解析微生物多样性,但由于其无法区分活体与死亡的微生物DNA片段,很容易造成结果与真实值出现偏差。采用两种方法相结合可以较为准确的获得发酵过程中真菌多样性及变化规律,有助于我们解析发酵过程中不同真菌微生物的作用,为今后的强化添加、菌种筛选以及机械化生产提供理论支撑。

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