响应面法优化微波辅助米渣蛋白糖基化改性工艺

,, ,*,

(1.安徽师范大学 环境科学与工程学院,安徽芜湖 241002;2.浙江省生物工程重中之重学科,浙江万里学院,浙江宁波315100;3.食品科学与技术国家重点实验室,江南大学,江苏无锡 214122)

米渣是以大米为原料生产抗生素、有机酸和淀粉糖等工业产品的副产品。在大米糖浆的生产过程中,每加工100 t大米,约产生14.5 t米渣。据统计,目前我国每年可产生5×105t以上的米渣副产品[1-2]。米渣主要成分为蛋白质、少量淀粉和脂肪等物质,其中蛋白质在米渣中所占比例因生产工艺的差异而不同,约占米渣质量50%～70%[3]。在大米糖浆的生产过程中,会经历很高的温度和压力,这些加工措施会造成大米蛋白质结构和氨基酸含量及比例的剧烈变化,这不仅降低了蛋白质的溶解度,而且影响了米渣蛋白的功能性质,限制了米渣蛋白在食品工业中的应用[4-5]。

近年来,微波作为一种新型食品加工技术,已在食品热加工领域得到广泛应用,如利用微波场产生的热效应诱导蛋白质结构的变化,达到杀菌的目的[6];除此之外,微波加热还应用于蛋白质的改性,如Liu等[7]为了提高蛋白纤维的韧性,采用微波对小麦蛋白进行加热处理,发现微波加热小麦蛋白结构更为平滑,毛孔较少,并且明显增加了小麦蛋白的吸水性。

美拉德反应是食品体系热加工过程中经常发生的一种反应,即蛋白质链上的氨基酸与还原糖发生接枝反应,通过该反应改善食品体系的稳定性和食品的功能性质。基于此,研究人员利用该反应对蛋白质的结构进行修饰,以改善其溶解性、乳化性等性能。王治平等[8]采用湿热法在米渣蛋白结构上接枝葡萄糖,对美拉德反应的产物进行评价发现,接枝后的米渣蛋白疏水性降低,并且接枝修饰后的米渣蛋白α-螺旋结构减少,β-螺旋结构增加,并且米渣蛋白结构较为分散。杜研学等[9]采用干热美拉德接枝反应对米渣谷蛋白进行糖基化改性,发现接枝卡拉胶后的米渣谷蛋白溶解性、乳化性和乳化稳定性显著提高,并且改善了米渣谷蛋白在不同pH范围内的功能性质。华静娴[10]利用微波加热研究米蛋白-葡聚糖美拉德反应,并对接枝工艺进行优化,接枝度最大达48.1%,这高于普通加热接枝反应的接枝率;此外还发现微波加热能加速蛋白质的降解,促使体系产生更多的氨基酸,从而为美拉德反应提供更多的底物[11]。但是,米渣经过高温高压处理后,其结构均已发生变化,微波场作用下,米渣蛋白是否可以接枝上糖类物质,进而改变其溶解性等性质尚未可知。

因此,本研究以米渣蛋白为研究对象,利用微波辅助接枝海藻酸钠,通过考察接枝产物的接枝度和褐变度,对微波辅助米渣蛋白糖基化改性工艺进行优化,旨在获得高效、安全的蛋白质改性方法,为米渣蛋白的工业化应用提供理论指导。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

米渣 江西麻姑实业有限公司;脂肪酶(酶活10000 U/g) 江苏锐阳生物科技有限公司;糖化酶(酶活10000 U/g) 江苏锐阳生物科技有限公司；盐酸、氢氧化钠、邻苯二甲醛(OPA)、十二烷基硫酸钠(SDS)、β-巯基乙醇、海藻酸钠 均为分析纯,实验用水为蒸馏水,所需溶液均为自配。

RJ-LDL-50G低速大容量多管离心机 无锡瑞江分析仪器有限公司;HH-S2系列恒温水浴锅 江苏金坛市环宇科学仪器厂;NJL07-3 实验用微波炉 南京杰全微波设备有限公司;加热磁力搅拌器、FE20 型pH计 德国IKA;ACPHA1-4型冷冻干燥机 CHRIST公司;TGL-16G高速台式离心机 上海安亭电子仪器厂;UV-1601 PC 紫外可见分光光度计 日本岛津公司;B-191型实验型喷雾干燥机 瑞典Buchi公司。

1.2实验方法

1.2.1 米渣蛋白的制备 采用去杂法制备米渣蛋白(Rice dreg protein,RDP),工艺流程如下:

脂酶脱脂的条件为:pH9.0、脂肪酶添加量为650 U/g、酶解温度50 ℃、酶解时间90 min;脱脂米渣脱糖的条件为:液固比6、加酶量600 U/g、酶解温度62.49 ℃、酶解时间88.44 min、超声波功率139.88 W,在此条件下蛋白质的质量分数为92.68%(经脱脂、脱糖后所得产物中的蛋白质含量)。

1.2.2 米渣分离蛋白与海藻酸钠共价接枝物的制备 参考陆钫[12]的方法,稍作修改。准确称取一定量的米渣蛋白配成质量分数为2%(w/w)蛋白溶液,用1 mol/L NaOH调pH至12.0,在50 ℃下磁力搅拌30 min使蛋白溶解,冷却至室温,按一定配比加入海藻酸钠,磁力搅拌20 min,使蛋白与海藻酸钠充分混合均匀,用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH调节pH至所需值,磁力搅拌10 min。取米渣蛋白与海藻酸钠混合溶液50 mL加入到100 mL圆底烧瓶中,置于实验用微波炉内,装好回流装置,采用间歇式微波加热反应。待反应结束立即放入冰水浴中冷却5 min,结束反应。

1.2.3 接枝反应评价指标的测定

1.2.3.1 接枝度(DG)的测定 用邻苯二甲醛(OPA)法[13]测定接枝度,其中OPA试剂要现配现用。准确称取40.0 mg的OPA,用1.0 mL甲醇溶解,溶解完全后加入2.5 mL 20%(w/w)的十二烷基硫酸钠(SDS),25.0 mL 0.1 mol/L硼砂,100 μLβ-巯基乙醇,最后用蒸馏水定容到50 mL。测定时,取4.0 mL OPA试剂于试管中,加入200 μL冷却的米渣蛋白与海藻酸钠反应溶液,混合均匀后在35 ℃水浴中反应2 min,最后在340 nm下测吸光值At,空白样的配制为向4.0 mL OPA试剂中加入200 μL水,在340 nm测定的吸光度为A0。按如下公式计算接枝度。

公式中,DG:接枝度,%;A0:空白样的吸光度;At:反应2 min后溶液的吸光度。

1.2.3.2 褐变度的测定 参照Sun[14]的方法,准确量取1.0 mL米渣蛋白与海藻酸钠接枝反应物,与5.0 mL 0.1%(w/w)SDS溶液混合,在420 nm下测定吸光值A420,以SDS溶液作空白,吸光度反映了美拉德反应的褐变程度。

1.2.4 单因素实验设计 分别以接枝度和褐变度为指标,研究微波功率、微波时间、微波温度、pH、海藻酸钠:RDP质量比对接枝反应的影响:

1.2.4.1 微波功率对RDP与海藻酸钠接枝反应的影响 分别选取50、100、150、200、250 W微波功率,其它条件为:微波时间15 min、微波温度90 ℃、调pH10.0、海藻酸钠:RDP质量比为3∶1。

1.2.4.2 微波时间对RDP与海藻酸钠接枝反应的影响 分别选取5、10、15、20、25、30 min微波时间,其它条件为:微波功率250 W、微波温度90 ℃、调pH10.0、海藻酸钠:RDP质量比为3∶1。

1.2.4.3 微波温度对RDP与海藻酸钠接枝反应的影响 分别选取50、60、70、80、90 ℃微波温度为实验条件,其它条件为:微波功率250 W、微波时间20 min、调pH10.0、海藻酸钠:RDP质量比为3∶1。

1.2.4.4 pH对RDP与海藻酸钠接枝反应的影响 分别选取pH8.0、9.0、10.0、11.0、12.0作为实验条件,其它条件为:固定微波功率250 W、微波时间20 min、微波温度80 ℃、海藻酸钠:RDP质量比为3∶1。

1.2.4.5 海藻酸钠:RDP质量比对RDP与海藻酸钠接枝反应的影响 分别选取1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1的海藻酸钠:RDP质量比,其它条件为:微波功率250 W、微波时间20 min、微波温度80 ℃、调pH10.0。

1.2.5 响应面实验设计 在单因素实验的基础上,根据Central Composite实验设计原理,以接枝度为响应值,通过响应面分析对RDP与海藻酸钠接枝条件进行优化,获得最优接枝工艺条件。每组实验重复三次,取其平均值。中心组合实验的因素水平如表1所示。

表1 中心组合实验因素水平表Table 1 The factors and levels of central composite design

1.3数据统计分析

所有数据均为三次实验平均值,误差项为标准偏差;用Origin 8.5软件对数据进行图形化处理;SPSS Statistics 17.0对数据进行相关性分析。

2 结果与讨论

2.1微波功率对接枝反应的影响

在前期的实验过程中发现,微波功率对接枝反应影响显著,并且微波功率高于300 W接枝反应过于剧烈,难以控制,因此为便于操作控制选择50～250 W进行研究。由图1可知,接枝率和褐变度都随着微波功率的增加而增加。功率在50～150 W范围内时,接枝率随着功率的升高而逐渐增加;随后,当微波功率在150～200 W之间时,接枝率的上升速度较快;微波功率大于200 W时,接枝率上升速度变慢,此研究结果与华静娴[15]相同。

图1 微波功率对接枝反应的影响Fig.1 Effect of the power of microwave radiation on the grafting reaction

2.2微波时间对接枝反应的影响

米渣蛋白与海藻酸钠之间发生美拉德反应,主要是RDP分子中氨基酸侧链上的自由氨基与海藻酸钠分子末端的还原性羟基之间的羟胺反应[16]。如图2所示,在反应5～30 min内,褐变度均呈上升趋势。接枝率在10～20 min内增加迅速,之后趋于平缓,20 min以后接枝率出现轻微下降趋势。这是因为微波加热使蛋白质分子内部的暴露出来,与多糖结合的几率增加,接枝度随之上升;但不断加热,高温会促进接枝物发生水解,不利于接枝反应的进行[17];并且酪氨酸在长时间加热过程中结构遭到破坏,与此同时,蛋白质结构的持续展开导致蛋白质之间的相互作用也逐渐增大,并最终形成凝聚和沉淀,不利于接枝反应的进行。

图2 微波时间对接枝反应的影响Fig.2 Effect of the time of microwave radiation on the grafting reaction

2.3反应温度对接枝反应的影响

如图3所示,接枝反应的接枝率及褐变度都与温度的变化呈正相关。温度达到80 ℃后,接枝度的变化不明显,但在反应过程中褐变度均呈上升趋势。升高温度,会促进美拉德反应的进行。这主要是因为高温还可能一方面使得蛋白质发生水解,自由氨基含量增加[18],促进接枝反应;另一方面是因为蛋白质结构打开内部氨基暴露出来,与海藻酸钠发生反应,会进一步使反应程度加大[19]。但随着温度的升高,接枝物发生水解,当蛋白质的水解率大于接枝率时,反应的接枝率出现下降的趋势。

图3 反应温度对接枝反应的影响Fig.3 Effect of the temperature on the grafting reaction

2.4反应体系pH对接枝反应的影响

在美拉德反应过程中,酸碱度对美拉德反应的进程具有重要影响。氨基酸分子在碱性溶液中带正电荷,此时容易发生美拉德反应,但是碱性太强的环境会破坏蛋白质的一级结构,造成如脱氨、脱羧和肽键断裂等变化,反而对接枝反应不利,因此一般情况下美拉德反应体系的pH处于3.0～10.0之间[20]。

如图4所示,当pH<10,随着碱性增强,接枝反应的接枝率和褐变度随之增大;pH=10.0时,接枝率最大,之后趋于稳定并有下降趋势。一方面是因为美拉德反应是碱性条件下发生的反应,随着碱性的增强,氨基酸与还原糖之间的反应效率增加[21];另外一方面是因为RDP中90%为谷蛋白,谷蛋白是碱溶性蛋白,蛋白质溶解度的增大也有利于反应的进行;但碱性太强,会使蛋白质发生水解,结构发生改变,对美拉德反应不利。

图4 反应体系pH对接枝反应的影响Fig.4 Effect of pH on the grafting reaction

2.5海藻酸钠与米渣蛋白质量比对接枝反应的影响

在美拉德反应体系中,多糖和蛋白两种反应底物的浓度对反应程度均具有重要影响,当体系中一种底物浓度固定时,提高另一种底物的浓度会增加底物分子之间的相互碰撞机会[22-23],加速美拉德反应的进程;但随着底物浓度的进一步提高,当另一种反应物用量继续增加至一定程度时,两种反应物存在的空间位阻作用,阻隔了分子之间的碰撞,导致碰撞几率下降,反应受阻[24]。因此,反应体系中适当比例的多糖和蛋白质能加速美拉德反应的进程。

如图5所示,体系中海藻酸钠浓度的增加,褐变度随之增加,接枝度先增加后降低。这可能是因为随着体系中海藻酸钠的浓度升高,溶液的粘度上升,蛋白质和海藻酸钠的空间位阻作用增强[25-26],当海藻酸钠:米渣分离的比例大于2∶1时,空间位阻作用阻碍了RDP和海藻酸钠相互接触。

图5 海藻酸钠与RDP质量比对接枝反应的影响Fig.5 Effect of the ratio of RDP to sodium alginate(w/w)on the grafting reaction

2.6米渣分离蛋白与海藻酸钠接枝反应工艺条件的响应面优化

对表2中的实验结果进行二次回归拟合分析,得出如下回归模型:

Y(%)=+35.56-1.42A-0.32B+2.19C+1.02D-1.10AB+0.00074AC+0.14AD-0.33BC-53BD-0.026CD-3.55A2-1.33B2-1.00C2-0.45D2

表2 中心组合实验设计及实验结果Table 2 Experimental design and results based on central composite design

表3 实验结果方差分析Table 3 Variance analysis of experimental results

注:*.显著(p<0.05),**.极显著(p<0.01)。

根据表3中方差分析结果,对具有显著相互交互影响的因素进行响应曲面分析,结果如图6(a-f)所示。从图6可以看出,海藻酸钠:RDP对接枝度的影响要明显大于pH对接枝度的影响(A>B);同时,可从图6(d)直观看出加微波功率对接枝反应的影响大于pH对接枝度的影响(C>B);而且从图6(f)看出温度对接枝度的影响大于pH对接枝度的影响(D>B)。因此,结合表3可得出在模型范围内各因素对接枝度的影响顺序为:C>A>D>B。

由响应面、等高线和回归方程分析可知,RDP-海藻酸钠接枝的最优工艺参数为:海藻酸钠:米渣分离蛋白质量比1.88∶1、pH10.18、微波功率186 W、微波温度77.7 ℃,在此条件下接枝度为36.87%,与实验设计中心点的最大值37.03%误差在5%范围内。为了操作的方便性对最优参数进行校正:米渣分离蛋白-海藻酸钠质量比1.9∶1、pH10.0、微波功率186 W、微波温度78 ℃,在此条件下进行三次验证实验,实测接枝率分别为36.67%、36.12%、36.92%,得出三次平均值36.57%,与预测值的RSD%为0.81%,在误差允许范围内。因此,所建立的优化模型准确可靠。

图6 不同因素对接枝反应的交互影响响应面图及等高线图Fig.6 Surface and contour plots of mutual-influence of different factors on grafting reaction

3 结论

本研究以米渣分离蛋白和海藻酸钠为原料,利用微波对米渣蛋白进行接枝改性处理,通过单因素和中心组合实验设计,考察海藻酸钠∶米渣分离蛋白质量比、微波温度、微波时间、微波功率、pH对接枝度和褐变度的影响,并建立米渣分离蛋白与海藻酸钠接枝反应的二次回归模型,通过该模型得到米渣分离蛋白和海藻酸钠接枝的最优参数为:海藻酸钠∶米渣分离蛋白质量比1.88∶1、pH10.18、微波功率186 W、微波温度77.7 ℃,且各因素对接枝反应的影响顺序为:功率>pH>海藻酸钠:米渣分离蛋白质量比>温度,此条件下接枝度为36.87%。采用微波辅助米渣蛋白接枝海藻酸钠进行美拉德反应改性,不仅耗时短、效率高,而且杂质少,从米渣蛋白资源增值化利用的角度看,能为进一步工业化生产提供依据。后续研究可对米渣蛋白与海藻酸钠接枝反应产物进一步鉴定,阐明米渣蛋白与海藻酸钠接枝反应的机理,在此基础上实现对米渣蛋白美拉德反应的调控,并探讨接枝产物对食品体系稳定性和食品品质的影响。

[1]汪玉海. 大米加工现状与趋势[J]. 农业工程技术(农产品加工业),2008,6:18-22.

[2]罗舜菁,勤耿,颜小燕,等. 不同脱脂条件下脱脂米渣蛋白的结构及功能性质研究[J]. 食品科学,2017,38(5):202-207.

[3]张美,李庆,李一林,等. 米渣营养成分测定及其蛋白质提取工艺优化[J]. 食品科学技术学报,2015,33(6):65-71.

[4]赵贵川. 超高压处理对米渣蛋白水解物抗氧化活性的影响[D]. 长沙:中南林业科技大学食品科学与工程学院,2016:1-11.

[5]刘珊珊,陈季旺,陈露,等. 米渣发泡蛋白的理化性质及形态结构[J]. 中国粮油学报,2015,30(4):33-38.

[6]Bozkurt-Cekmer H,Davidson P M. 11-Microwaves for microbial inactivation—efficiency and inactivation kinetics[M]. The Microwave Processing of Foods(Second Edition). Cambridge:Woodhead Publishing,2016:220-251.DOI:10.1016/B978-0-08-100528-6.00011-5.

[7]Liu C,Ma X. Study on the mechanism of microwave modified wheat protein fiber to improve its mechanical properties[J]. Journal of Cereal Science,2016,70:99-107. DOI:10.1016/j.jcs.2016.05.018.

[8]王治平,何荣海,丁文慧,等. 葡萄糖接枝改性对米渣分离蛋白乳化性及结构的影响[J]. 中国粮油学报,2017,32(2):43-48.

[9]杜研学,史苏华,熊华,等. 米渣谷蛋白卡拉胶糖基化改性及功能性质[J]. 食品科学,2011,32(16):11-15.

[10]华静娴,陈正行,钟芳. 大米蛋白-葡聚糖接枝耦联反应的研究[J]. 食品科学,2008,29(12):45-50.

[11]Quitain A T.,Daimon H,Fujie K,et al. Microwave-assisted hydrothermal degradation of silk protein to amino acids[J]. Industrial & Engineering Chemistry Research,2006,45(13):4471-4474.

[12]陆钫. 美拉德反应改进大米蛋白功能性质的研究[D]. 无锡:江南大学,2008:29-40.

[13]史苏华. 米渣谷蛋白-卡拉胶糖基化改性及其价接枝物乳化性能研究[D]. 南昌:南昌大学,2011:13-14.

[14]Sun W W,Yu S J,Zeng X A,et al. Properties of whey protein isolate-dextran conjugate prepared using pulsed electric field[J]. Food Research International,2011,44(4):1052-1058.

[15]华静娴. 米蛋白-葡聚糖微波加热接枝耦联反应的研究[D]. 无锡:江南大学,2008:18-25.

[16]张智刚,聂小华,王宁,等. 微波场中米蛋白-葡聚糖接枝反应的工艺研究[J]. 浙江农业科学,2013,1(8):1019-1022.

[17]李超,程云辉,黄强,等. 微波场中大米蛋白-糊精接枝反应的工艺研究[J]. 食品工业科技,2012,33(3):263-267.

[18]Ajandouz E,Desseaux V,Tazi S,et al. Effects of temperature and pH on the kinetics of caramelisation,protein cross-linking and Maillard reactions in aqueous model systems[J]. Food Chemistry,2008,107(3):1244-1252.

[19]赵磊,赵磊,王旋,等. 大豆分离蛋白-多糖美拉德反应共聚物的制备及性能研究[J]. 食品科技,2015(8):256-261.

[20]管军军,裘爱泳,刘晓亚,等. 微波辐射大豆分离蛋白-糖接枝反应条件的研究[J]. 食品与生物技术学报,2005,24(5):16-20.

[21]Ta N G N L,G Kmen V. Effect of alkalization on the Maillard reaction products formed in cocoa during roasting[J]. Food Research International,2016,89,Part 2:930-936.

[22]Abdelhedi O,Mora L,Jemil I,et al. Effect of ultrasound pretreatment and Maillard reaction on structure and antioxidant properties of ultrafiltrated smooth-hound viscera proteins-sucrose conjugates[J]. Food Chemistry,2017,230:507-515.

[23]Yang S,Lee S,Pyo M C,et al. Improved physicochemical properties and hepatic protection of Maillard reaction products derived from fish protein hydrolysates and ribose[J]. Food Chemistry,2017,221:1979-1988.

[24]Spotti M J,Martinez M J,Pilosof A M R,et al. Influence of Maillard conjugation on structural characteristics and rheological properties of whey protein/dextran systems[J]. Food Hydrocolloids,2014,39:223-230.

[25]Evans M,Ratcliffe I,Williams P A. Emulsion stabilisation using polysaccharide-protein complexes[J]. Current Opinion in Colloid & Interface Science,2013,18(4):272-282.

[26]Semenova M. Protein-polysaccharide associative interactions in the design of tailor-made colloidal particles[J]. Current Opinion in Colloid & Interface Science,2017,28:15-21.