明胶-壳聚糖-海藻酸钠凝胶包埋木瓜蛋白酶的研究

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(1.北京食品营养与人类健康高精尖创新中心,北京工商大学,北京 100048;2.食品添加剂与配料北京市高校工程研究中心,北京 100048)

海藻酸钠是由1,4-聚-B-D-甘露糖醛酸和A-L-古罗糖醛酸构成的线型聚合物,其具有无毒无害、不容易降解及生物相容性好等优点[1-2]。在温和条件下,海藻酸钠可以实现对蛋白质等生物大分子的包埋[3]。壳聚糖分子构成为(1,4)-2-氨基-2脱氧-β-D-葡萄糖胺,是天然多糖高分子材料[4],因其无毒、具有生物可降解性、生物活性等特性而具有广泛应用[5-6]。明胶是由胶原部分水解而得到的一类蛋白质,具有组织相容性、低抗原性、成膜性等优良特性[7-8],为固定化酶的优良载体[9]。用于固定化酶的天然高分子材料还有淀粉、甲壳素等[10]。因明胶、壳聚糖、海藻酸钠来源广泛、生物相容性好、成本低廉等优点,故选作本研究固定化酶的载体。

近年来,使用复配材料逐渐成为固定化酶研究的热门。张智等[11]利用海藻酸钠、海藻酸钠-明胶、海藻酸钠-壳聚糖固定化磷脂酶,根据酶学特性得到最佳载体为海藻酸钠-壳聚糖混合材料。陆兵等[12]对红芝LYL263漆酶进行不同凝胶体系的固定化研究发现海藻酸钠-壳聚糖-明胶固定化漆酶酶活最高。微胶囊作为固定化载体,扩散性是一重要指标[13]。有研究者指出有明胶参与的胶囊网孔更大,更有利于物质的包埋和内外物质的扩散[14]。但纯明胶存在干燥后质地脆、可被蛋白酶酶解[15]等缺点,通常对明胶进行改性处理以提高其稳定性等性能。

本文分别使用明胶和改性明胶与壳聚糖、海藻酸钠固定木瓜蛋白酶,以硬度和酶活为指标进行比较研究,评价了使用明胶和改性明胶对固定化木瓜蛋白酶的影响,为固定化木瓜蛋白酶提供了一种新思路。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

海藻酸钠、壳聚糖、明胶、无水CaCl2、盐酸、二水合磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢二钠、无水碳酸钠、三氯乙酸、25%溶液戊二醛 国药集团化学试剂有限公司;木瓜蛋白酶(活力4.96×105U/g)、福林酚试剂、三羟甲基氨基甲烷 Sigma公司;干酪素 北京奥博星生物技术有限责任公司;L-酪氨酸 天津市光复精细化工研究所;L-谷胱甘肽 拜尔迪生物技术有限公司。

CP214电子天平 上海市奥豪斯仪器有限公司;pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;CT-3质构仪 美国Brookfield公司;HH-2数显恒温水浴锅 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司;DF-101S恒温磁力搅拌锅 河南省巩义市予华仪器有限责任公司;超声波清洗机 南京先欧生物科技有限公司;UVmini-1240紫外可见光分光光度计 日本岛津公司。

1.2实验方法

1.2.1 明胶/改性明胶-壳聚糖-海藻酸钠对木瓜蛋白酶的包埋

1.2.1.1 明胶-壳聚糖-海藻酸钠对木瓜蛋白酶的包埋 称取一定质量的明胶、壳聚糖、海藻酸钠,溶于100 mL一定pH0.1 mol/L的Tris-盐酸缓冲液中,磁力搅拌30 min至完全溶解，冷却至室温后取20 mL。然后加入0.01 g木瓜蛋白酶,搅拌均匀。用一次性滴管将上述搅拌均匀的溶液缓慢滴入一定浓度的CaCl2中,形成凝胶球。放入4 ℃冰箱储存,30 min后将凝胶球捞出,用去离子水反复洗净,滤干,用于测定酶活。

为便于测定凝胶球硬度,将其制备成相应的凝胶块,在烧杯中加入5 mL一定浓度CaCl2溶液铺满烧杯底部,取80 mL凝胶液迅速倒入其中,然后沿烧杯壁缓慢加入CaCl2溶液,可制得凝胶块(厚(1.3±0.1) cm),放入4 ℃冰箱,24 h后测硬度。

1.2.1.2 改性明胶-壳聚糖-海藻酸钠对木瓜蛋白酶的包埋 采用前人研究的结果[16],使用明胶抗水解能力强的条件改性明胶:称取4 g明胶溶于20 mL、pH6的PBS缓冲液,溶解后加入0.9%戊二醛改性16 min。得到改性明胶溶液,改性明胶浓度为0.2 g/mL。

称取壳聚糖与海藻酸钠粉末,溶于一定体积一定pH的Tris-盐酸缓冲液,加入相应体积的改性明胶,磁力搅拌30 min至完全溶解，冷却至室温后取20 mL加入0.01 g木瓜蛋白酶,搅拌均匀。用一次性滴管将上述搅拌均匀的溶液缓慢滴入一定浓度的CaCl2中,形成凝胶球,放入4 ℃冰箱储存,30 min后将凝胶球捞出,用去离子水反复洗净,滤干,用于测定酶活。

为便于测定凝胶球硬度,将其制备成相应的凝胶块,在烧杯中加入5 mL一定浓度CaCl2溶液铺满烧杯底部,取80 mL凝胶液迅速倒入其中,然后沿烧杯壁缓慢加入CaCl2溶液,制得凝胶块(厚(1.3±0.1) cm),放入4 ℃冰箱,24 h后测硬度。

1.2.2 明胶/改性明胶-壳聚糖-海藻酸钠固定木瓜蛋白酶单因素实验

1.2.2.1 不同质量浓度组成对包埋木瓜蛋白酶的影响 根据预实验成球效果确定明胶/改性明胶-壳聚糖-海藻酸钠的质量浓度见表1,其中固定CaCl2浓度为0.6 mol/L,Tris-盐酸缓冲液pH7。

表1 明胶/改性明胶-壳聚糖-海藻酸钠的质量浓度Table 1 Gelatin/modified gelatin-chitosan-sodium alginate concentration

1.2.2.2 CaCl2浓度对包埋木瓜蛋白酶的影响 用0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mol/L的不同浓度的CaCl2溶液,其中固定明胶、改性明胶质量浓度均为0.3%、壳聚糖质量浓度为0.3%、海藻酸钠质量浓度为2.4%,Tris-盐酸缓冲液pH7。

1.2.2.3 缓冲液pH对包埋木瓜蛋白酶的影响 使用pH6、6.5、7、7.5、8的Tris-盐酸缓冲液,其中固定明胶、改性明胶质量浓度均为0.3%、壳聚糖质量浓度为0.3%、海藻酸钠质量浓度为2.4%,CaCl2浓度0.6 mol/L。

表2 使用明胶/改性明胶的优化实验因素水平表Table 2 Factors and levels table for the trial of gelatin/modified gelatin

1.2.3 明胶/改性明胶-壳聚糖-海藻酸钠固定木瓜蛋白酶优化实验 根据单因素实验的结果选择较优变化的范围,确定相应的水平,最终确定均匀优化实验方案,选取明胶/改性明胶质量浓度、壳聚糖质量浓度、海藻酸钠质量浓度、CaCl2浓度、以及缓冲液pH五个因素。综合考虑硬度酶活两个指标,利用DPS软件设计均匀实验优化方案见表2。

1.2.4 酶活力测定方法 参照福林酚法测酶活[17-18]酶活力单位定义为在1 min内催化酪蛋白水解生成1 μg酪氨酸的酶量为一个活力单位(U)。固定化酶活力单位根据载体质量以U/g表示。

1.2.5 硬度测定方法 参照bloom法[19],使用CT-3质构仪,测定条件为:柱塞P0.5;压力5 g,速度1 mm/s。每个样品作三个平行样,重复测定三次取平均值。

1.3数据处理

实验中每个处理重复三次,实验各值均为三个平行数据的均值。采用DPSv15.10数据处理系统进行均匀实验设计。数据统计结果与分析应用 Microsoft Excel 2007、Origin 9.0和SPSS 22.0软件。

2 结果与分析

2.1明胶/改性明胶-壳聚糖-海藻酸钠共混固定木瓜蛋白酶单因素实验

2.1.1 不同质量浓度组成对包埋木瓜蛋白酶的影响 结果分别见图1、图2。

图1 三种组成成分对硬度的影响Fig.1 Effect of the three components on the hardness

根据图1得出使用改性明胶与使用明胶相比对硬度的影响无显著性差异,这与体系中明胶的量较少,硬度主要受海藻酸钠的影响有关。由图2可知,一定组成的明胶、壳聚糖和海藻酸钠包埋可以提高酶活,使用明胶制备得到第5组酶活最大。使用改性明胶第6组酶活最大。根据此结果同时考虑到三种物质组成的体系复杂,三者相互作用未知,优化实验选择相应物质的浓度范围进行优化,确定明胶浓度范围0.15%～0.45%,壳聚糖浓度范围0.15%～0.45%,海藻酸钠浓度范围2.25%～2.55%;改性明胶浓度范围0.15%～0.45%,壳聚糖浓度范围0.15%～0.45%,海藻酸钠浓度范围2.25%～2.55%。第4、5组使用明胶的酶活显著高于使用改性明胶的酶活(p<0.05),6、8、9、10组使用改性明胶酶活显著提高(p<0.05)。酶活变化情况复杂分析原因与体系的复杂组成有关,海藻酸钠是固定化酶颗粒成球的主要因素,浓度较低时,表面形成的固定化膜强度不够,容易分离,造成酶活力低。当海藻酸钠浓度过高时,颗粒表面结构致密膜强度高,造成酶活降低。壳聚糖浓度过高也会使固定化颗粒表面膜致密,造成底物扩散困难,降低酶活[20]。明胶浓度影响凝胶结构的孔径[21],适宜浓度的明胶可以提高酶活。实验结果表明一定组成条件下明胶改性后可提高酶活。推测明胶改性后发生变化,与壳聚糖-海藻酸钠之间产生影响,对其固定化酶结构或酶产生了影响。

2.1.2 CaCl2浓度对包埋木瓜蛋白酶的影响 结果分别见图3、图4。

图3 CaCl2浓度对硬度的影响Fig.3 Effect of CaCl2 concentration on hardness

图4 CaCl2浓度对酶活的影响Fig.4 Effect of CaCl2 Concentration on enzyme activity

由图3可以得出,凝胶硬度随CaCl2浓度上升而提高,使用改性明胶和使用明胶相比硬度无显著性差异。由图4得到酶活随CaCl2浓度增大先增大后减小。Yen[22]利用海藻酸钠胶囊固定化米根霉研究发现CaCl2增会增加固定化胶囊的厚度,增加传质阻力。CaCl2浓度增大可能增加酶扩散阻力,导致CaCl2浓度增加酶活降低。有研究者研究得到CaCl2浓度高不利于酶活[19]。

表3 使用明胶均匀实验结果表Table 3 Uniform experimental results of gelatin

解释为当CaCl2较高时,钙离子会布满凝胶表面,影响酶的作用,从而不利于酶活。使用改性明胶后酶活提高,改性后明胶抗酶解能力显著增强[15],明胶更好发挥其作用,更有利于物质的包埋和内外物质的扩散[13]。改性明胶酶活最大值18.99 U/g,使用明胶最大酶活12.51 U/g,使用改性明胶与明胶相比提高了52%。

2.1.3 pH对对包埋木瓜蛋白酶的影响 结果分别见图5、图6。

图5 pH对硬度的影响Fig.5 Effect of pH on hardness

图6 pH对酶活的影响Fig.6 Effect of pH on enzyme activity

由图5可知,硬度在pH7.5时出现最大值。黄正华等[23]研究海藻酸钠壳聚糖凝胶,pH7时凝胶硬度达到最大。赵谋明等[24]研究表明,离子强度明显影响海藻酸钠和明胶的相互作用,推出明胶与海藻酸钠主要为静电力作用。pH过低时,海藻酸钠含量多,带负电荷少起作用,使三者静电作用力小硬度低。pH过高,海藻酸钠相互间存在斥力,明胶-壳聚糖与海藻酸钠静电吸引作用小,硬度下降。使用改性明胶与使用明胶的结果对比,在pH6.5、7.5时,明胶改性后硬度降低了25%、20%,孙言蓓等[25]利用乙二胺改性,使得明胶部分基团发生变化,氨基增加,使得明胶溶液黏度降低。在pH6.5、7.5明胶改性后可能对体系粘度产生影响从而使得硬度发生改变。图6结果表明,酶活随pH先增大后减小,pH7时酶活最大。游离木瓜蛋白酶最适合pH7,固定化后最适合pH未改变。使用改性明胶酶活最大值21.66 U/g,使用明胶酶活最大值14.67 U/g,使用改性明胶使酶活提高了48%。

2.2明胶/改性明胶-壳聚糖-海藻酸钠固定木瓜蛋白酶优化实验

根据DPS软件设计均匀实验并进行实验。使用明胶和改性明胶结果分别如表3、表4所示,采用偏最小二乘回归分析方法对混合水平均匀实验结果进行分析。得到最优条件:明胶质量浓度0.45%,壳聚糖质量浓度0.42%,海藻酸钠质量浓度2.55%,CaCl2浓度0.8 mol/L,缓冲液pH7.5;改性明胶质量浓度0.45%,壳聚糖质量浓度0.15%,海藻酸钠质量浓度2.55%,CaCl2浓度0.8 mol/L,缓冲液pH6.5。

表4 使用改性明胶均匀实验结果表Table 4 Uniform experimental results of modified gelatin

表5 理论值与实测结果比较Table 5 Comparison of theoretical values with measured results

在最优条件下进行两组验证实验,将得到的实际值与数据处理系统得到的预测值进行比较,如表5所示。使用明胶酶活相对误差3.68%,硬度相对误差9.25%;使用改性明胶酶活相对误差8.30%,硬度相对误差7.30%。数据系统分析模型的理论值与实测值相比可以说明预测模型具有一定的指导意义。对比使用改性明胶与使用明胶的优化实验结果发现,使用改性明胶后壳聚糖浓度、缓冲液pH更低,其他得到的优化条件相同。对比采用优化条件进行实验得到的酶活和硬度的结果,与使用明胶相比,使用改性明胶的酶活提高37%,硬度减少35%。

3 结论

本实验在单因素实验基础上,通过均匀实验,确定两组最佳条件:明胶质量浓度0.45%,壳聚糖质量浓度0.42%,海藻酸钠质量浓度2.55%,CaCl2浓度0.8 mol/L,缓冲液pH7.5。改性明胶质量浓度0.45%,壳聚糖质量浓度0.15%,海藻酸钠质量浓度2.55%,CaCl2浓度0.8 mol/L,缓冲液pH6.5。验证实验证明数据分析系统建立的模型具有一定指导意义。使用改性明胶可提高酶活,但硬度降低,与明胶相比酶活提高37%,硬度减少35%。

固定化木瓜蛋白酶的硬度和酶活受明胶、壳聚糖、海藻酸钠、CaCl2浓度和缓冲液pH等多种因素的影响。在今后的研究中,可以根据不同的研究目的选择使用明胶还是改性明胶,如考虑提高酶活,可以使用改性明胶。虽然目前对明胶、壳聚糖、海藻酸钠相互作用形成凝胶有一定的认识,但还不够深入,在机理等方面还有待于进一步的研究和探索。

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