高效液相色谱法测定营养品中的虫草素
2018-01-22郑国建
郑国建,李 珊
(雅培贸易(上海)有限公司,上海200233)
营养品中含有人体欠缺及损失的营养成分,这些成分是保持身体健康的必要物质。随着人们生活水平的提高,健康意识越来越强,我国营养品市场存在较大发展空间。
虫草素的化学名称为3′-脱氧腺苷,是冬虫夏草和蛹虫草的主要活性成分之一[1]。有研究表明虫草素可改善缺血小鼠的学习能力,促进海马神经元的修复[2],可抑制肺癌细胞株的增值和迁移过程[3],具有消炎[4]、抗肿瘤[5]、调节人体免疫功能等显著作用。基于虫草素的上述功能,将虫草素添加到营养品中可极大地提高产品附加值,可调节人体的生理机能,为消费者提供营养支持。
目前测定虫草素的方法主要用于测定冬虫夏草、蛹虫草及其发酵液中的虫草素含量[6-9],但是没有用于测定营养品中虫草素的方法。营养品基质复杂,含有淀粉、麦芽糊精、多种营养素和矿物质,容易对测定结果造成干扰。本工作采用高效液相色谱法测定营养品中虫草素的含量。
1 试验部分
1.1 仪器与试剂
Agilent 1260型高效液相色谱仪,配二元泵、在线真空脱气机、自动进样器、进样器温控、柱温箱、多波长检测器(MWD);Milli-Q型纯水系统。
虫草素标准储备溶液:200.0mg·L-1,称取标准品20.00mg于100mL容量瓶中,用水溶解并定容,在-20℃冰箱中保存,备用。
偏磷酸溶液:30.0g·L-1,称取偏磷酸30.00g于装有约600mL水的1L烧杯中,在磁力搅拌器上溶解,转移至1L容量瓶中,用水定容。
偏磷酸为分析纯,乙腈为色谱纯,试验用水为纯水。
1.2 色谱条件
Phenomenex Gemini C18色 谱 柱 (250mm×4.6mm,5μm);柱温35℃;流量1.0mL·min-1;进样量20μL;流动相A为水,B为乙腈。梯度洗脱程序:0~16.0min时,A 为95%;16.0~16.1min时,A由95%线性降至10%;16.1~23.0min时,A为10%;23.0~23.1min时,A 由10%线性升至95%;23.1~30.0min时,A 为95%。紫外检测波长为260nm。
1.3 试验方法
称取营养品样品10.00g,加水至50.00g,加入磁力搅拌子,在磁力搅拌器上搅拌10min,使其充分溶解。从稀释好的样品里称取2.50g溶液至50mL容量瓶中,加水30mL,混匀,超声10min,加入30.0g·L-1偏磷酸溶液1.0mL,轻轻振荡,加水稀释至刻度,样品经0.22μm滤膜过滤后进液相色谱分析。
2 结果与讨论
2.1 样品预处理条件的选择
试验使用速溶虫草素作为营养品的原料,采用干法工艺的方式进行添加,所以在样品处理过程中要对样品进行复溶,以尽可能减少由于样品不均匀造成的测定值波动。
农业行业标准 NY/T 2116-2012[10]中使用水直接提取样品中的虫草素。但是在试验中发现如果只加水溶解提取营养品中的虫草素,得不到澄清的液体,不利于后续的液相色谱分析。所以样品处理过程中应加入适当的沉淀剂。
沉淀样品中干扰物质的方法主要包括有机溶剂沉淀法[11]、盐沉淀法[12]及酸碱沉淀法[11]。鉴于对操作人员的身体健康及沉淀效果的考虑,试验使用30.0g·L-1偏磷酸溶液。
试验发现偏磷酸溶液用量会改变虫草素的出峰时间,其出峰时间随偏磷酸溶液用量的增加而减少。这会导致虫草素不能和杂质分离,且在后续的色谱图定量过程中造成处理软件找不到对应的目标峰。试验确定30.0g·L-1磷酸溶液1.0mL已可沉淀样品,且不对虫草素的出峰时间和分离造成影响。
2.2 色谱条件的选择
试验考察了SB C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)、XDB C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)和 Gemini C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)对目标物的分离效果,结果发现:Gemini C18色谱柱可以很好地将虫草素和杂质分离,其他两种色谱柱会存在基质干扰。所以试验选择Gemini C18色谱柱。
在最佳色谱条件下对空白基质、标准溶液及阳性样品进行分析,其色谱图见图1。
图1 空白基质、标准溶液和阳性样品的色谱图Fig.1 Chromatograms of blank matrix,standard solution and positive sample
由图1可知,目标物得到了很好的分离,没有基质干扰。
2.3 标准曲线及检出限
按试验方法对0.05,0.10,0.20,0.40,0.60,1.00mg·L-1的虫草素标准溶液进行测定,结果表明:虫草素的质量浓度在0.05~1.00mg·L-1内与其峰面积呈线性关系,线性回归方程为y=57.7 x,相关系数为0.999 9。
采用在空白基质中添加目标物的方法,以10倍信噪比计算得到虫草素的测定下限(10S/N)为5.0mg·kg-1。
2.4 精密度与回收试验
取空白营养品样品若干份,分别加入虫草素标准溶液,使样品中虫草素的质量比分别为5.0,40.0,60.0mg·kg-1,按试验方法平行测定6次,计算回收率及测定值的相对标准偏差,结果见表1。
表1 精密度与回收试验结果(n=6)Tab.1 Results of tests for precision and recovery(n=6)
由表1可知:加标回收率在100%~102%之间,测定值的相对标准偏差在1.5%~3.4%之间。
2.5 方法准确性
使用NY/T 2116-2012中描述的方法对虫草素原料进行测定,同时使用本方法分析添加了该虫草素原料的营养品,其中每54.8g营养品中含1g虫草素原料。
分别测定原料和营养品各6次,取平均值。原料中虫草素的质量比为1.97mg·g-1,所以营养品中虫草素质量比的理论值为35.95mg·kg-1。使用本方法实际测得营养品中虫草素的质量比为35.32mg·kg-1。测定值和理论值的相对误差为1.8%。
本工作建立了测定营养品中虫草素含量的方法,对样品前处理中的沉淀剂进行了优化,最终选择30.0g·L-1偏磷酸溶液1.0mL作为沉淀剂。该方法稳定、可靠、准确,适用于营养品中虫草素的测定。
[1] PATERSON R R.Cordyceps- a traditional Chinese medicine and another fungal therapeutic biofactory?[J].Phytochemistry,2008,69(7):1469-1495.
[2] 蔡昭林,李楚华,王晓琦,等.虫草素改善脑缺血小鼠学习记忆及对海马神经元数量的影响[J].华南师范大学(自然科学版),2012,44(3):95-99.
[3] 刘昌杰.虫草素对体外培养肺癌细胞株A549恶性生物学行为的调节及其相关miRNA表达的关系[J].海南医学院学报,2015,21(12):1597-1600.
[4] JEONG J W,JIN C Y,KIM G Y,et al.Anti-inflammatory effects of cordycepin via suppression of inflammatory mediators in BV2microglial cells[J].International Immunopharmacology,2010,10(12):1580-1586.
[5] RUMA I M,PUTRANTO E W,KONDO E,et al.Extract of Cordyceps militaris inhibits angiogenesis and suppresses tumor growth of human malignant melanoma cells[J].International Journal of Oncology,2014,45(1):209-218.
[6] KUMAR H,SPANDANA M.Simultaneous extraction,determination and analysis of adenosine,cordycepin and other derivatives of cordycepssinensis of Nepal by new validated HPLC method[J].Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry,2013,2(4):43-45.
[7] HUANG L F,LIANG Y Z,GUO F Q.Simultaneous separation and determination of active components in Cordycepssinensis and cordycepsmilitarris by LC/ESIMS[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical A-nalysis,2003,33:1155-1162.
[8] YANG F Q,GE L Y,WAN H Y.Determination of nucleosides and nucleobases in different species of Cordyceps by capillary electrophoresis-mass spectrometry[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical A-nalysis,2009,50:307-314.
[9] 简利茹,杜双田.HPLC与LC-MS/MS测定蛹虫草发酵液中虫草素的方法比较[J].食品科学,2013,34(14):276-279.
[10] NY/T 2116-2012 虫草制品中虫草素和腺苷的测定.
[11] 汪家春,徐军,李兆兰,等.HPLC测定冬虫夏草中的虫草素[J].食品与药品,2015,17(4):263-266.
[12] GILL B D,INDYK H E,KUMAR M C,et al.A liquid chromatographic method for routine analysis of 5′-mononucleotides in pediatric formulas[J].Journal of AOAC International,2010,93(3):966-973.