牛蒡子苷元对人骨肉瘤MG-63细胞增殖及细胞凋亡的影响

顾启滨， 邓立明,*， 钟诚

骨肉瘤是常见的原发骨恶性肿瘤，在中国每年发病率约为3／100万，预后较差，多发生在10～20岁青少年，死亡率较高，给社会和家庭带来了严重的经济及生活负担［1］。目前传统的治疗方法存在很多缺陷，如不良反应严重及容易复发等。牛蒡子苷元是我国传统中药牛蒡子果实中提取分离而来的木脂素类化合物，在临床研究中具有悠久的历史，除了作为传统中药治疗风热感冒、痈肿疮毒等［2］，牛蒡子苷元还具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤等多重功效［3－4］。已证实牛蒡子苷元可通过介导乳腺癌MDA－MB－231细胞的凋亡来抑制肿瘤细胞的生长，通过触发线粒体凋亡途径导致Bax相关蛋白的上调和Bcl－2相关蛋白表达水平的下调，促进细胞凋亡信号的产生，从而诱导细胞凋亡［5］。同时牛蒡子苷元能够抑制结肠癌CT26细胞血管生成，能够降低VEGFR－2的基因水平［6］。牛蒡子苷元对人骨肉瘤细胞系MG－63的增殖及凋亡作用尚未见报道，本研究探讨不同浓度的牛蒡子苷元对骨肉瘤细胞MG－63增殖及凋亡作用的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人骨肉瘤细胞系MG－63购自美国模式培养物集存库（ATCC），于本研究室液氮中保存；RPMI－1640培养基购买自Hyclone公司 （美国）；胰蛋白酶 （Trypsin），青霉素＆链霉素（Penicillin－Streptomycin， P.S.） 及胎牛血清 （FBS） 购买自 Gibco公司 （美国）；二甲基亚砜 （DMSO），DEPC水购买自索莱宝公司 （北京）；甲醛、丙二醇、无水乙醇、氯仿、异丙醇购自广州化学试剂厂 （广州）；Prime Script RT reagent Kit－RNA反转录试剂盒，SYBR Premix Ex Taq荧光定量PCR试剂盒购自TAKARA公司 （日本）；牛蒡子苷元购于上海晶都生物技术有限公司；PEG400购于上海生物工程股份有限公司；Annexin V－FITC细胞凋亡检测试剂盒、 Cell Counting Kit－8 （CCK－8试剂盒）均购于上海碧云天生物技术有限公司；RNA提取试剂盒购于北京全式金生物技术有限公司。

1.2 牛蒡子苷元配制 称取适量的牛蒡子苷元溶于DMSO中，充分溶解后配置成1 mg／mL浓度的母液，将母液用50 mM醋酸钠溶液分别稀释成为 3 个工作浓度 （10 μg／mL、 50 μg／mL、100 μg／mL）， 溶液中包括 40%PEG400， 调节 pH 值至 5.0， 过滤除菌后－20℃保存备用。

1.3 人骨肉瘤细胞MG－63的培养 将人骨肉瘤细胞系MG－63用含 10%胎牛血清的DMEM 培养基 （含 100 μg／mL青霉素、100 μg／mL链霉素）于37℃、5%CO2的恒温培养基中培养，细胞融合度达到70%～80%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.4 细胞增殖分析 细胞增殖的分析按照CCK－8试剂盒说明进行操作试验。取对数生长期的MG－63细胞，在96孔板中每孔加入100微升2 000个细胞，分别加入10 μL配置好的不同浓度的牛蒡子苷元溶液，药物对照为含DMSO的缓冲液，再加入10 μL CCK－8溶液，空白对照为加入100 μL细胞培养液，实验做三个重复。于37℃、5%CO2的恒温培养基中培养，分别在0 h、12 h、24 h、48 h、72 h时加入CCK8试剂，孵育1 h后酶标仪测定450 nm吸光值，进行结果统计分析。

1.5 流式检测MG－63细胞凋亡 取对数期生长的MG－63细胞，按照1×105／mL铺于48孔板，过夜生长后加入不同浓度（10 μg／mL、 50 μg／mL、 100 μg／mL） 牛蒡子苷元， 对照为牛蒡子苷元配置缓冲液，实验做三个重复。细胞用药物刺激24 h后，把细胞培养液吸出至一合适离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶细胞消化液 （不含EDTA）消化细胞。加入 5 μL Annexin V－FITC， 轻轻混匀。 加入 10 μL碘化丙啶染色液，混匀后待测。室温 （20℃～25℃）避光孵育10～20分钟，随后置于冰浴中，用流式细胞仪检测分析细胞凋亡情况。

1.6 荧光定量PCR检测相关基因表达 对基因Bax（引物Forward： CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG； Reverse： CCAGCCCAT GATGGTTCTGAT）、 Bcl－2 （引物 Forward： GGTGGGGTCATGTGTGTGG； Reverse： CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC） 和 VEG FR－2 （引物 Forward： GGCCCAATAATCAGAGTGGCA； Reverse：CCAGTGTCATTTCCGATCACTTT）进行荧光定量PCR检测。收集药物处理24 h后的MG－63细胞，用RNA提取试剂盒提取细胞RNA。RNA反转录采用Prime Script反转录试剂盒进行。在4℃环境或者冰上，向RNase－Free的 8连管 （Axygen，200 μL容量） 中加入 2 μL 5× Prime Script Buffer， 0.5 μL RT Enzyme Mix， 0.5 μL Oligo dT Primer （50 μM）， 0.5 μL Random 6 mers（100 μM）， RNA 500 ng， RNase－Free H2O 调整至 10 μL， 混匀后离心。反转录反应条件为：37℃15分钟 （反转录反应），85℃5秒 （反转录酶的失活反应）。实时荧光定量PCR反应采用SYBR Premix Ex Taq试剂盒 （Takara公司）进行。在冰上或4℃操作环境下配制20 μL PCR反应液：10 μL SYBR Premix Ex Taq （2× ）， 0.4 μL Forward Primer （10 μM） ， 0.4 μL Reverse Primer （10 μM）， 2 μL DNA 模板 （100 ng）， 7.2 μL ddH2O。 混匀，离心后，用Bio－Rad CFX96荧光定量PCR仪中进行反应，反应选用两步法程序，退火温度60℃。基因的表达差异通过分析实验组、对照组的目的基因和管家基因，经2－△△CT方法进行比较；每个样本的每个基因均做三个重复，取平均值进行最后的统计学分析。

1.7 统计学方法 应用SPSS 13.0统计学软件进行统计学分析。采用两因素的方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 牛蒡子苷元对骨肉瘤细胞MG－63增殖的影响 实验在细胞水平检测了不同浓度牛蒡子苷元对人骨肉瘤细胞MG－63增殖的影响 （图1），随着细胞生长时间的延长，MG－63细胞处于增殖状态。而与对照相比较发现，牛蒡子苷元对细胞MG－63增殖具有明显的抑制作用，并且随着药物剂量的增加，其抑制效率更加明显。

图1 牛蒡子苷元对骨肉瘤细胞MG－63增殖的影响

2.2 牛蒡子苷元对骨肉瘤细胞MG－63凋亡的影响 用不同浓度的牛蒡子苷元处理骨肉瘤细胞MG－63，用流式细胞仪检测其对细胞凋亡的影响 （图2），从结果中发现随着牛蒡子苷元浓度的增加，凋亡的MG－63细胞明显增加。该结果提示牛蒡子苷元对骨肉瘤细胞MG－63细胞增殖的影响可能与其凋亡有关。从图中看出在对照组中发生凋亡的细胞占总细胞数的1.88%；在 1 μg／mL 药物浓度下， 凋亡细胞上升至 8.83%； 在 5 μg／mL药物浓度下，凋亡细胞上升至15.9%；在 10 μg／mL药物浓度下，凋亡细胞上升至36.0%。药物处理组与对照相比较凋亡细胞百分比具有显著差异。

图2 流式检测牛蒡子苷元对骨肉瘤细胞MG－63凋亡的影响

2.3 荧光定量PCR检测牛蒡子苷元对相关基因表达的影响 进一步对不同浓度牛蒡子苷元处理过的MG－63细胞提取其RNA，反转录后对Bcl－2、Bax、VEGFR－2基因进行荧光定量PCR检测 （图3）。随着牛蒡子苷元浓度的增加，基因Bcl－2的表达水平呈下降趋势，Bcl－2具有抑制细胞凋亡的作用，这提示着牛蒡子苷元能够下调Bcl－2基因的表达，从而促进MG－63细胞的凋亡。同时检测了促凋亡基因Bax的表达水平，结果显示随着药物浓度的增加，其Bax的表达水平明显上升，这提示着药物能够增加对细胞凋亡的影响。血管内皮细胞生长因子受体2（VEGFR－2）能够促进血管的生成，随着牛蒡子苷元浓度的增加，VEGFR-2基因的表达下降，提示药物具有抑制骨肉瘤细胞MG－63血管生成的作用。

图3 荧光定量PCR检测牛蒡子苷元对Bcl－2、Bax和VEGFR－2基因表达的影响

3 讨论

天然药物作为抗肿瘤药物研发的重要来源被广大学者广泛关注。天然抗肿瘤药物具有其特有的治疗机制，同时临床效果明显、毒副作用弱，已经被越来越多的研究证明。目前临床使用量已占到肿瘤治疗药物的3／4。随着近年来对牛蒡子苷元的研究及广泛的临床前研究，发现牛蒡子苷元具有广泛的药理活性，不仅具有调控炎性因子的表达和免疫调节的作用，还具有抑制多种肿瘤的作用， 如乳腺癌［6］、 肺癌［7］、 膀胱癌［8］、 结肠癌等［9］。其作用机制主要集中在阻止细胞周期G0／G1期，或在G2／M期抑制肿瘤细胞的增殖；然而牛蒡子苷元在骨肉瘤中的作用及机制尚未有研究报道。

本研究结果显示，在没有药物干预的情况下MG－63细胞一直处于增殖状态。经过牛蒡子苷元处理后，其增殖会受到明显抑制，并且随着药物剂量的增加，其抑制效率更加明显。采用流式细胞术检测不同浓度的牛蒡子苷元处理后骨肉瘤细胞MG－63的凋亡情况 （图2），结果也证实随着牛蒡子苷元浓度的增加，凋亡的MG－63细胞明显增加。上述结果提示牛蒡子苷元对骨肉瘤细胞MG－63细胞增殖的影响可能与其凋亡有关。进一步的统计学处理也表明药物处理组与对照相比较凋亡细胞百分比具有显著差异。为了探讨牛蒡子苷元杀伤MG－63细胞的机制，本研究对不同浓度牛蒡子苷元处理过的MG－63细胞提取其RNA，反转录后对Bcl－2、Bax、VEGFR－2基因进行荧光定量PCR检测 （图3）。在细胞凋亡过程中，Bcl－2家族成员起着至关重要的作用。Bcl－2是细胞死亡的负调因子，在许多类型的细胞受到外界刺激时能保护细胞免于凋亡。随着牛蒡子苷元浓度的增加，Bcl－2基因的表达水平呈下降趋势，Bcl－2具有抑制细胞凋亡的作用，这提示牛蒡子苷元能够下调Bcl－2基因的表达，从而促进MG－63细胞的凋亡。Bax是Bcl－2同源相关蛋白，Bax的过度表达可拮抗Bcl－2的保护效应而使细胞趋于死亡。本研究结果也显示随着药物浓度的增加，Bax的表达水平明显上升，这提示着药物能够增加对细胞凋亡的影响。

血管内皮细胞生长因子受体2（VEGFR－2）能够促进血管的生成，在促进肿瘤的发生发展过程中起到重要的作用。随着牛蒡子苷元浓度的增加，VEGFR－2基因的表达下降，提示药物具有抑制骨肉瘤细胞MG－63血管生成的作用。

本研究结果表明，牛蒡子苷元能够抑制MG－63细胞的增殖，同时能够使其发生细胞凋亡。在基因水平检测细胞凋亡相关的基因发现，牛蒡子苷元也能够降低凋亡抑制基因Bcl－2的表达水平，提高促凋亡基因Bax的表达水平，而且对血管生长因子受体VEGFR－2基因的表达也有抑制作用。这些结果都表明，在细胞水平牛蒡子苷元具有抗骨肉瘤细胞MG－63的作用。本研究为体外试验，牛蒡子苷元抗骨肉瘤的生物活性还需建立体内试验进行进一步的验证，其药物作用的精确靶点及其作用机制还需要深入研究，为牛蒡子苷元进一步的改构及临床应用提供基础。

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