剩余胚胎养囊后冻融囊胚临床结局分析

詹 玲，易晓芳，罗 伟

（三峡大学仁和医院生殖中心，湖北 宜昌 443001）

目前大多数生殖中心评价胚胎移植的标准主要还是形态学评分，但随着囊胚相关技术的逐渐成熟完善，新鲜周期移植冷冻后剩余的胚胎继续培养至囊胚期，再行冷冻已成趋势，且这一方法的临床价值和结局已引起诸多学者的关注和研究。已有相关文献多次报道[1，2]，D3低形态学评分的胚胎在体外继续培养有部分胚胎能发育成优质囊胚，说明这一部分胚胎依然具有不同程度的发育潜能。这也引起大家对于移植胚胎选择标准的重新审视，如何更全面地评估移植胚胎将是生殖学者亟需解决的难题。

本研究回顾性研究新鲜周期中D3移植冷冻优质胚胎后剩余胚胎的发育情况，选择合适囊胚行玻璃化冷冻，择期行冻融胚胎移植。分析比较D3优质卵裂胚胎和D5、D6冻融囊胚移植后的临床结局，探讨剩余胚胎继续培养至囊胚的临床应用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取我院2013年1月～2015年11月常规IVF/ICSI治疗周期中D3对优胚行移植或冷冻（最多不超过6个），剩余胚胎（患者已签署知情同意书）继续培养，对形成的囊胚进行评级，选择符合标准的囊胚行玻璃化冷冻。收集2015年1～2015年11月在本中心行囊胚解冻的患者106个周期，这些囊胚均由新鲜周期中剩余胚胎形成，解冻后培养2小时观察囊胚扩张后进行移植。2015年1～2015年11月本中心行D3卵裂期冻融胚胎移植的患者186个周期。

1.2 试剂和耗材

1.2.1 D3胚胎评分标准

I级：胚胎卵裂球均匀，胞质清晰，碎片＜5%；

II级：胚胎卵裂球均匀，碎片＜20%；

III级：胚胎卵裂球均匀或不均匀，碎片＞20%；

IV级：胚胎卵裂球严重不均匀，碎片＞50%。

注：D1正常受精来源的6～10细胞的I和II级胚胎为优胚，可以移植或冷冻。

1.3 剩余胚胎

包括D3非优胚、所有D1非正常受精来源（0PN和1PN）以及小部分优胚（D3优胚＞6）。

1.4 冷冻囊胚标准

参照Gardner囊胚评分标准[3]将囊胚发育分为6级，1级：早期囊胚，囊腔体积小于总体积50%；2级：囊胚腔体积大或等于总体积50%；3级：囊胚腔几乎占满整个胚胎；4级：囊胚腔进一步扩大，透明带变薄；5级：正在孵化的囊胚；6级：囊胚完全孵出。内细胞团分级：A级：细胞数目多，排列紧密；B级：细胞数目较少，结合较松散；C级：细胞数目极少。滋养层细胞分级：A级：上皮细胞层细胞数目多，结构致密；B级：上皮细胞层细胞数目较少，结构松散；C级：上皮细胞层细胞稀疏。将D5或D6评分≥4CB的囊胚予以冷冻。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行分析，计数资料采用x2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 囊胚形成情况对新鲜周期妊娠结局的预测

2015年本中心新鲜周期798个，新鲜周期移植冷冻后有继续培养周期451个，继续培养胚胎数2277枚，形成囊胚1441枚，囊胚形成率63.3%，冷冻囊胚940枚，囊胚冷冻率41.3%。新鲜周期中有继续培养的周期临床妊娠率明显高于无继培周期；其中有继培周期中，有囊胚冷冻的周期相比无囊胚冷冻周期，临床妊娠率明显升高，结果均有显著性统计学差异；差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 新鲜周期与无继培周期比较

2.2 剩余胚胎养囊后冻融囊胚与D3冻融胚胎临床结局比较

2015年1～2015年11月在本院生殖中心由新鲜周期移植冷冻后剩余胚胎发育的囊胚复苏移植的患者共106个周期188枚囊胚，其中D5囊胚解冻52个周期94枚胚胎，复苏率97.9%，D6囊胚解冻55个周期94枚胚胎，复苏率92.6%，两者复苏率没有统计学差异。D3冻融胚胎解冻186个周期381枚胚胎，复苏率99.0%，与D6囊胚复苏率有统计学差异；差异有统计学意义（P＜0.05）。与D3冻融胚胎相比，冻融囊胚平均移植胚胎数明显减少，而临床妊娠率和种植率明显升高，且流产率和异位妊娠率也明显降低。其中D5与D6相比，种植率和双胎率有统计学差异，差异有统计学意义（P＜0.05）；D5与D3相比，临床妊娠率和种植率有统计学差异，差异有统计学意义（P＜0.05），其他比较均没有统计学差异。见表2。

2.3 D5与D6冻融囊胚移植数目不同及其临床结局比较

106个冻融囊胚周期其中有35例单囊胚移植，将不同移植数目的D5与D6冻融囊胚之间相互比较，临床妊娠率和种植率均无统计学差异。见表3。

表2 剩余胚胎养囊后冻融囊胚与D3冻融胚胎临床结局比较

表3 D5与D6冻融囊胚移植数目不同及其临床结局比较

3 讨 论

随着试管婴儿技术的不断发展，原核期评分和卵裂期形态评分已经不能完全反应胚胎的发育潜能[7]。但是若全部进行囊胚培养，导致可利用胚胎减少，周期取消率增加，因此目前大多数生殖中心依然以移植D3胚胎为主。通过继续培养剩余胚胎，冷冻有发育潜能的囊胚可提高胚胎利用率。

本中心结果显示继续培养胚胎2277枚，形成囊胚1441枚，冷冻囊胚940枚，囊胚形成率63.3%，，囊胚冷冻率41.3%。说明D3剩余胚胎确实具有相当大的发育潜能。本实验结果比戴志俊等[2，4]人报道的低等级或非优质胚胎继续培养结果囊胚形成率和囊胚冷冻率均要高，分析原因可能与本实验室纳入继培胚胎较严格和冷冻囊胚标准较宽有关系。本实验室D3剩余胚胎主要是D3非优胚，所有D1非正常受精来源（0PN和1PN），还有一部分移植冷冻后剩余优胚，D3冷冻胚胎最多不超过6个，因此优胚较多的患者会有一部分优胚纳入继续培养。其次，本中心囊胚冷冻标准较宽，只要是内细胞团达到B级或者滋养层达到B级就考虑冷冻。但是我们的临床结果表明，确实有一部分评分较差的囊胚依然可以获得临床妊娠，一方面不同生殖中心评价囊胚的主观性不同，另外囊胚腔的扩张会遮挡一部分内部形态而误导囊胚评分，因此我们会综合评价激光破膜后囊胚的塌陷情况再冷冻。

本研究中通过继续培养剩余胚胎形成囊胚，行冻融囊胚移植后得到了较好的临床妊娠率，甚至比D3冻融优胚结局更好，差异有统计学意义（P＜0.05）；冻融囊胚的平均移植胚胎数明显减少，尤其是D5冻融囊胚的种植率和双胎率都接近50%，对于部分情况较好且有优质囊胚的患者可以考虑单囊胚移植。研究者[8]发现冻融D5囊胚临床妊娠率要高于D6的囊胚，本研究结果中D5与D6妊娠率没有统计学差异，但D5冻融囊胚的种植率和双胎率明显高于D6且有统计学差异；差异有统计学意义（P＜0.05）。结果有异于许丽娟等[5]人的结果，可能与本中心评价冷冻囊胚的标准较宽有关。本实验结果没有筛选患者的基本情况，还需加大样本量继续研究。冻融囊胚的异位妊娠率和流产率均明显低于D3冻融胚胎，结果与Cong Fang[6]等人一致。

目前很多生殖中心都采用单囊胚移植，移植胚胎数少，降低双胎率，并维持较高水平的临床妊娠率。但大部分生殖中心依然常规移植2枚囊胚。表3结果显示移植数目不同，妊娠结局无明显不同，D5与D6之间临床妊娠率均无统计学差异。提示可根据囊胚质量选择性单囊胚冷冻。另外，本中心的35例单囊胚移植中（其中D5有12例，D6有23例），妊娠17例，这些囊胚几乎全部由非优胚形成，且有一部分囊胚评分较低，却依然可以使患者获得临床妊娠，说明不管是卵裂期还是囊胚期的形态学评分均不能完全评价胚胎的潜力，一部分低评分卵裂胚和囊胚依然具有较好的发育潜能。将这一部分D3剩余胚胎用于囊胚培养，可提高胚胎利用率。对于一些没有优胚移植或移植优胚依然不孕的患者，可移植剩余胚胎形成的囊胚。囊胚质量不同、移植数目不同其妊娠结局存在差异，如何根据患者的情况选择最佳移植方案将成为生殖学家的另一热点。

[1] Lerou PH,Yabuuchi A,Huo H,et al. Derivation and maintenance of human embryonic stem cells from poor-quality in vitro fertilization embryos[J].Nat Protoc,2008,3(5):923-933.

[2] 戴志俊,邹林兵,汪凌云,等.非优质卵裂胚胎继续培养至囊胚的临床应用研究[J].中国优生与遗传杂志,2015,05:118-119.

[3] 黄国宁,孙海翔.体外受精-胚胎移植实验室技术[M].人民卫生出版社,2012.

[4] 莫美兰,宋 成,张宏展,等.低等级胚胎继续培养的价值与其临床结局[J].生殖医学杂志,2012,03:205-208.

[5] 许丽娟,陈 薪,田小龙,等.非优良胚胎形成的囊胚与卵裂期优良胚胎的冻融胚胎移植的临床结局比较[J].南方医科大学学报,2015,04:481-485.

[6] Fang C,Huang R,Wei LN,et al.Frozen-thawed day 5 blastocyst transfer is associated with a lower risk of ectopic pregnancy than day 3 transfer and fresh transfer[J].Fertility and sterility,2015,103(3):655-661.

[7] Ren X,Liu Q,Chen W,et al.Selection and vitrification of embryos with a poor morphological score:a proposal to avoid embryo wastage r[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2012,32(3):405-409.

[8] 贾 磊,岳超敏,宫 晓,等.移植复苏周期第5日和第6日冻融囊胚发育潜能的比较[J].新医学,2013,11:748-751.