中药复方多糖对不同MHC B-LβII基因型鸡淋巴细胞IL-2、IL-4、IL-12 mRNA表达量的影响

马 昭，连科讯，刘 钢，刘晓婷，乔严杰，朱晓庆，谷新利

(石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意义】中药是我国的传统药物，它资源丰富、历史悠久，与西药相比具有毒副作用小，低残留，不易产生耐药等优点，是医药学研究的热点。随着中药药理学、遗传学、免疫学的相互渗透，人们对中药与机体免疫调节作用的研究愈加深入，发现中草药中的多种提取物可以参与机体免疫调节。中药多糖是一种从中草药中提取出的具有提高机体免疫力，抗病毒，抗氧化等多种作用的生物活性物质之一，它能够通过激活T、B 淋巴细胞和巨噬细胞等免疫细胞，促进细胞因子的生成，激活补体系统等方式调节机体免疫系统，进而发挥免疫调节作用。并且中药多糖的免疫调节作用受剂量的影响，即中药多糖的免疫增强作用有其最适剂量[1-3]。【前人研究进展】细胞表面存在着与免疫排斥有关的组织抗原，称为组织相容性抗原(histocompatibility antigen),而编码组织相容性抗原的是具有高度多态性的基因群，称为主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)。MHC编码的蛋白与免疫识别、免疫应答有关，因此MHC在某种程度上决定动物个体对疾病的易感性，在适应性免疫应答中起着非常重要的作用。Shanaz等[4]应用PCR-SSCP方法对Bantam、BWLH和WLH 3个鸡种的MHCB-LβII多态性与免疫应答相关性进行研究，发现B-Lβ II基因的等位基因B15和B19单倍体鸡ND和SRBC抗体滴度均显著高于其他单倍体，是优势基因型。朱晓庆等[5]研究发现，一定纯度中药复方多糖的免疫调节剂量的筛选会受MHCB-LβII基因Hin1I位点多态性的影响，且一定纯度中药复方多糖对不同MHCB-LβII基因型鸡的最适免疫调节剂量不同。【本研究切入点】MHC II类分子不仅被CD4 T细胞识别，是CD4 T识别的靶分子，而且参与外源性抗原呈递、免疫应答和免疫调节。不同个体间由于MHC II基因多态性使得MHC II 类分子接纳与提呈抗原具有一定的选择性，导致不同个体对同一抗原表现出免疫应答强弱的差异。【拟解决的关键问题】试验从细胞分子水平拟排除MHCB-LβII多态性而导致的不同基因型机体免疫应答能力不同的影响，筛选出能显著增强与鸡免疫功能相关的各MHCB-LβII基因型鸡免疫的中药复方多糖的最佳剂量。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 药物

中药复方多糖由党参、山楂、熟地、何首乌、当归、茯苓、补骨脂等11味中药组成，各单味药均购自石河子市医药公司；中药复方多糖粗提取物是从中药复方中采用水提-醇沉法提取，再经AB-8大孔吸附树脂吸附解吸附后获得精制的中药复方多糖，即cCHMPS，其纯度为77.10%；用不含血清的RPMI-1640培养液将其配置成200、150、100 μg/mL的cCHMPS，经0.22 μm微孔滤膜滤过后4℃储存备用。

1.1.2 试剂与仪器

鸡外周血淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司产品)；RPMI 1640培养基，PBS磷酸缓冲液，胎牛血清，SYBR Green荧光染料，RT-PCR试剂(北京全式金生物技术有限公司产品)；DEPC(上海生物工程公司产品)；鸡新城疫疫苗(La Sota株，普莱柯生物工程股份有限公司产品)；TaqDNA聚合酶，RNA、DNA提取试剂盒，胶回收试剂盒，RNAprep Pure Cell/Bacteria k-it(北京田根生物工程有限公司产品)；高速冷冻离心机，垂直离心机。

1.2 方 法

1.2.1 DNA的提取

500羽1日龄京红1号蛋鸡，购自新疆昌吉某一孵化场。翅下静脉采血0.2 mL/羽，置于肝素钠抗凝采血管中摇匀，-20℃冷冻保存。按DNA提取试剂盒的操作说明书提取鸡全血DNA，4℃冰箱保存备用。

1.2.2 引物设计

根据GenBank中收录的鸡MHC B-LβⅡ基因序列(NO.M29763.1)，应用Oligo软件设计引物，引物序列为：上游引物：5’-AAACCGACCGTCTGGCGTGCTA-3’，下游引物：5’-TTACCCCACGCCTGGCTGAT-3’，扩增片段238 bp，引物由华大基因科技股份有限公司合成。

1.2.3 PCR扩增

PCR扩增体系为20 μL：10 μL 的2×RCRMix，2 μL模板DNA，上下游引物各0.5 μL，7μL ddH2O，总体积为20 μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min；94℃变性40 s，60.5℃退火45 s，72℃延伸35 s，共35个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。取5 μL PCR 扩增产物在2 %琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统观察并拍照。

1.2.4 淋巴细胞的分离与成活率检测

根据PCR-SSCP基因型分型结果将鸡进行分组，然后静脉采集血液参照文献谢昆等[6]提取淋巴细胞，用胎盘蓝染色，在显微镜下数出死细胞和活细胞个数，计算活细胞的成活率。

1.2.5 试验分组与细胞培养

用含20%的胎牛血清的培养液将分离得到的淋巴细胞调整为5×106个/mL。试验按不同基因型分组，每组设3个剂量组，每个培养皿加入1 mL细胞培养液，然后加入不同浓度的cCHMPS，使终浓度分别达到100、75、50、0 μg/mL。将培养皿置于37℃、5%的CO2的恒温培养箱中共培养24 h后收集细胞。

1.2.6 鸡淋巴细胞总RNA提取

收集淋巴细胞，按照RNA提取试剂盒说明书提取淋巴细胞的总RNA。RNA纯度检测：检测其D260 nm/D280 nm比值，其比值在1.8～2.0。

1.2.7 RNA反转录

将2 μL 5×gDNA Graser Buffer、1 μL gDNA Eraser、5 μL RNase Free Water、2 μL RNA模板混匀，42℃反应2 min，迅速冰浴，即反应液Ⅰ，最后将1 μL Prime Scriptrt MIXⅠ、1 μL RT Primer MIX、4 μL 5×Primscript buffer、4 μL RNase Free Water加入反应液Ⅰ中，37℃反应15 min，85℃加热5 s使反转录酶失活，取出EP管，-20℃贮存备用。

1.2.8 cDNA的PCR反应体系与程序

IL-2、IL-4、IL-12及β-Actin基因的引物设计与合成：根据GenBank报道的IL-2、IL-4、IL-12及β-Actin基因mRNA的全长序列设计RCR特异性引物，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列见表1。

表1 目的基因引物序列及PCR条件
Table 1 Conditions of PCR and parameters of oligonucleotide primer pair

目的基因Targetgene登录号GenBankNo产物Products引物序列(5′→3)Sequenceofprimer(5′→3)退火温度AnnealingtemperatureIL-2GU＿119890．1188bpF：CACACCAACTGAGACCTGR：TCTTGCATTCACTTCCGGTGT58℃IL-4GU＿119892．1382bpF：AACATGCGTCAGCTCCTGAAR：CCATTGAAGTAGTGTTGCCTGCT60℃IL-12NM＿213571．1133bpF：GAGTGGAACGATGAGACACCAGR：CCTTCACTTCGGTGGTCAGAG58℃β-ActinNM＿205518．1100bpF：ACCGCAAATGCTTCTAAACCR：ATAAAGCCATGCCAATCTCG59℃

cDNA的PCR反应体系：1 μL cDNA模板，上游引物和下游引物各0.5 μL，8 μL ddH2O，10 μL 的2×RCRMix，总体积为20 μL。PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。

1.2.9 实时荧光定量PCR

荧光定量PCR反应体系：2×TransStart®Tip Green qPCR SuperMIX 10 μL，上下游引物各0.5 μL，1 μL cDNA，8 uL ddH2O，20 μL体系。反应程序为：94℃预变性30 s；94℃变性5 s；退火15 s，72℃延伸10 s，共42个循环。

1.3 数据处理

用 2 -△△ Ct法计算目的基因IL-2、IL-4、IL-12 mRNA的相对表达量。所有数据结果以均数±标准差( x±SD)表示。用 SPSS 17.0 软件分析，计量资料采用t检验，所有统计分析结果以P<0.05 作为差异显著性的判断标准，并且将对照组的mRNA的相对表达量设置为1。

2 结果与分析

2.1 MHC B-LβII基因PCR扩增结果

用所设计的引物对基因组DNA进行扩增，取所得PCR产物5 μL于的琼脂糖凝胶上进行电泳，扩增产物检测结果为，所设计引物的扩增结果较好，片段长度与预期大小一致，条带清晰，无非特异性条带，可直接进行SSCP分析。图1

1：DNA Maker I， 2-11：MHC B-LβII基因(MHC B-LβII Gene)

图1 MHC B-LβII基因PCR扩增结果
Fig.1 The PCR amplification results of MHC B-L II gene

2.2 PCR-SSCP

对所有DNA样本的PCR产物进行SSCP多态性检测，发现所扩增片段有3种基因型，分别定义为AA (103羽)、BB(266羽)和BC(131羽)。图2

注：1、6、8、10、12：BC基因型；3、5：AA基因型；2、4、7、9、11、13：BB基因型

Note: 1、6、8、10、12：BC genotype； 3、5：AA genotype； 2、4、7、9、11、13：BB genotype

图2 部分鸡MHC B-LβII基因PCR-SSCP电泳图谱
Fig.2 Electrophoretic patterns of the PCR-SSCP product of MHC B-LβII gene

2.3 IL-2、IL-4、IL-12及β-Actin扩增结果

用所设计的鸡IL-2、IL-4、IL-12及β-Actin 基因的引物，以 cDNA 为模板进行 PCR扩增，经2%琼脂糖凝胶电泳检测，分别获得了188、382和133 bp的目的条带。图3

2.4 中药复方多糖对不同MHC B-LβII基因型鸡外周血淋巴细胞中IL-2 mRNA表达量

研究表明，与对照组相比，cCHMPS能显著促进鸡淋巴细胞IL-2 mRNA的表达，且在不同基因型鸡中，最有效提高IL-2 mRNA表达量所需的cCHMPS剂量不同。AA基因型鸡中，cCHMPS剂量为75、50 μg/mL时，鸡淋巴细胞IL-2 mRNA表达量显著高于其他剂量组(P<0.05)；BB基因型鸡中，cCHMPS剂量为100 μg/mL时鸡淋巴细胞 IL-2 mRNA表达量均显著高于其他剂量组(P<0.05)；BC基因型鸡中，cCHMPS剂量为50 μg/mL时，IL-2 mRNA表达量均显著高于其他剂量组(P<0.05)。表2

1: IL-12基因(IL-12 gene)；2：IL-4基因(IL-4 gene)；3：IL-2基因(IL-2 gene)；4：内参(β-Actin gene)；5：Maker

图3 IL-2、IL-4、IL-12及β-Actin凝胶电泳图
Fig.3 Electrophoretic patterns of the PCR product of IL-2、IL-4、IL-12 and β-Actingene表2 中药复方多糖对各基因型鸡淋巴细胞IL-2 mRNA表达
Table 2 Effect of traditional Chinese medicine compound polysaccharide of each genotype chicken IL-2 mRNA expression level

基因型Genotype不同剂量的中药复方多糖 DifferentdosesofChineseherbalcompoundpolysaccharides0μg/mL50μg/mL75μg/mL100μg/mLAA基因型 AAGenotype1189±001a∗182±002a∗166±002b∗BB基因型 BBGenotype1167±004a∗163±005a∗181±002b∗BC基因型 BCGenotype1176±006a∗164±005b∗165±003b∗

注：同行肩注小写的字母表示同一基因型组不同cCHMPS剂量间的比较，肩注相同小写字母差异不显著(P>0.05)，肩注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，cCHMPS与对照组比较用*表示显著性差异(P<0.05)，下同

Notes : Comparison of cCHMPS doses between the same genotype groups, Shoulder note same, lowercase letters are not significant difference(P>0.05), and different weight letters indicate significant difference(P<0.05). The difference between cCHMPS and control group was marked by*.The same as below

2.5 中药复方多糖对不同MHC B-LβII基因型鸡外周血淋巴细胞中IL-4 mRNA表达量

研究表明，与对照组相比，cCHMPS能显著促进鸡淋巴细胞IL-4 mRNA的表达，且在不同基因型鸡中，最有效的提高IL-4 mRNA表达量所需的cCHMPS剂量不同。AA基因型鸡中，cCHMPS剂量为75、50 μg/mL时，鸡淋巴细胞IL-4 mRNA表达量显著高于其他剂量组(P<0.05)；BB基因型鸡中，cCHMPS剂量为100 μg/mL时鸡淋巴细胞 IL-4 mRNA表达量均显著高于其他剂量组(P<0.05)；BC基因型鸡中，cCHMPS剂量为50 μg/mL时，IL-4 mRNA表达量均显著高于其他剂量组(P<0.05)。表3

表3 中药复方多糖对各基因型鸡淋巴细胞IL-4 mRNA表达
Table 3 Effect of traditional Chinese medicine compound polysaccharide of each genotype chicken IL-4 mRNA expression level

基因型Genotype不同剂量的中药复方多糖 DifferentdosesofChineseherbalcompoundpolysaccharides0μg/mL50μg/mL75μg/mL100μg/mLAA基因型 AAGenotype1178±003a∗179±004a∗160±002b∗BB基因型 BBGenotype1164±002a∗161±003a∗171±006b∗BC基因型 BCGenotype1166±005a∗160±002b∗159±002b∗

2.6 中药复方多糖对不同MHC B-LβII基因型鸡外周血淋巴细胞中IL-12 mRNA表达量

研究表明，与对照组相比，cCHMPS能显著促进鸡淋巴细胞IL-12 mRNA的表达，且在不同基因型鸡中，最有效的提高IL-12 mRNA表达量所需的cCHMPS剂量不同。AA基因型鸡中，cCHMPS剂量为75、50 μg/mL时，鸡淋巴细胞IL-12 mRNA表达量显著高于其他剂量组(P<0.05)；BB基因型鸡中，cCHMPS剂量为100 μg/mL时鸡淋巴细胞 IL-12 mRNA表达量均显著高于其他剂量组(P<0.05)；BC基因型鸡中，cCHMPS剂量为50 μg/mL时，IL-12 mRNA表达量均显著高于其他剂量组(P<0.05)。表4

表4 中药复方多糖对各基因型鸡淋巴细胞IL-12 mRNA表达
Table 4 Effect of traditional Chinese medicine compound polysaccharide of each genotype chicken IL-12 mRNA expression level

基因型Genotype不同剂量的中药复方多糖 DifferentdosesofChineseherbalcompoundpolysaccharides0μg/mL50μg/mL75μg/mL100μg/mLAA基因型 AAGenotype1219±003a∗221±007b∗189±004b∗BB基因型 BBGenotype1190±004a∗186±008a∗218±003b∗BC基因型 BCGenotype1220±009a∗192±003b∗196±004b∗

3 讨 论

3.1 中药复方多糖对鸡淋巴细胞IL-2、IL-4、IL-12 mRNA表达量的影响

机体淋巴细胞在免疫应答中起着关键的作用[7]。淋巴细胞分泌的细胞因子是天然的免疫调节剂，是介导和调节免疫、炎症反应的一类细胞小分子糖蛋白，可以使靶细胞进行分化和增殖，进一步增强抗疾病的能力，参与调节机体的炎症反应以及免疫应答[8]。研究细胞因子有助于了解机体的免疫调节机制，近年研究发现中药多糖可以促进细胞因子分泌，其中IL-2、IL-4、IL-12等细胞因子在免疫应答中也充当着十分重要的角色。IL-2、IL-4、IL-12主要由淋巴细胞产生，在细胞生长分化和机体免疫调节作用中发挥着各自特有的作用。IL-2、IL-12是Th1细胞分泌的，激活巨噬细胞，通过调节巨噬细胞MHC II分子的表达,进而促进Th细胞分化为Th1细胞，最终增强机体的特异性免疫。IL-2不仅促进T、B淋巴细胞增生与分化产生抗体，而且在获得性免疫和机体天然免疫的发生与维持中发挥着重要作用[9-10]。此外，研究表明鸡IL-2蛋白可以作为免疫增强佐剂[11]。IL-4由Th2细胞分泌，可以抑制Th1细胞活化的能力，同时是IgE的诱导剂。IL-12具备多种免疫调节功能，不仅可以调节Th1细胞的活性，促进Th1细胞分泌细胞因子，增强Th1细胞的免疫应答，而且可以促进T细胞和NK细胞的增殖及杀伤作用，同时可以抑制Th2细胞分泌免疫因子的产生，即Th1细胞分泌的细胞因子可以抑制Th2细胞的增殖，反过来Th2细胞分泌的细胞因子可以调节Th1细胞的分化。

有研究表明，中药多糖能影响白介素，如IL-2、IL-4、IL-12的生成和表达，进而对机体进行免疫调节[12]。商云霞等[13]研究了中草药复方多糖对鸡INF-γ、IL-4和IL-12质量浓度的影响，发现不同剂量中药复方多糖均能提高INF-γ、IL-4和IL-12质量浓度，且中剂量中药复方多糖最好。李婉雁等[14]研究了白术多糖(PAM)对岭南黄鸡免疫功能的影响，结果发现PAM能促进雏鸡免疫器官中TNF-α、IL-2、IL-4及INF-γ mRNA的表达，且PAM有一定的剂量限制。徐占云等[15]研究了枸杞多糖(LPB)对雏鸡淋巴细胞体外增殖及分泌IL-2的影响，研究结果显示LPB能促进雏鸡淋巴细胞增殖和IL-2的分泌。Huang等[16]报道，地黄多糖能上调T淋巴细胞IL-2的分泌水平。另外，还有研究显示补益类中药有效成分可以促进IL-12、IL-2等细胞因子分泌，加强细胞因子的作用，激活B、T细胞，增强机体的细胞免疫和体液免疫，调节机体免疫，而中药多糖是其中药成分之一[17]。试验研究表明，不同剂量cCHMPS均能提高各基因型鸡IL-2、IL-4、IL-12 mRNA表达量，提示中药多糖增强机体抗病能力的分子机制之一可能是促进细胞因子分泌。当然，中药多糖虽然能促进机体IL-2、IL-4、IL-12 mRNA表达，但是并非越高越好，三者之间必须处于一定的平衡状态，才能维持机体正常的的体液免疫和细胞免疫。

3.2 鸡MHC B-LβII基因多态性对cCHMPS促进淋巴细胞IL-2、IL-4、IL-12 mRNA表达的剂量影响

鸡MHC基因家族在机体内发挥着很重要的生物学功能，同时鸡MHC抗原在体液免疫和细胞免疫中都发挥着重要的作用。T细胞表面有抗原结合的受体，简称TCR(T cell receptor)。TCR具有特异性，只与特定的抗原结合， TCR只识别结合在自身MHC分子上的抗原。大多数T细胞含有CD4和CD8膜分子，表达的CD4 T细胞只识别MHC II类分子递呈的抗原。CD4 T细胞作为辅助性T细胞(Th)，通过识别抗原递呈细胞(antigen-presenting cell，APC)MHC II类分子递呈的抗原而被活化，活化后的Th细胞分裂增殖，同时分泌各种细胞因子，参与调节免疫应答。此外，T细胞在识别外来抗原同时，还要识别MHC分子，说明T细胞受体在识别抗原需要依赖与抗原递呈的MHC分子[18]。

许多研究表明鸡多种传染病的抗性高度与MHC基因多态性相关，所以在研究家禽抗病育种试验中MHC基因成为了优选的标记基因[19]。李福伟等[20]研究表明个体以及品种之间存在不同免疫能力的遗传差异，并且不同的免疫性状存在显著的优势基因型。李尚民等[21]的研究发现鸡MHCB-LβII基因外显子2的遗传变异对京海黄鸡抗病能力影响显著，可作为球虫抗病能力选育候选基因。刘立波等[22]研究了鸡MHC B-L基因SNPs单倍体型与血清中IgG含量、LPS含量、禽流感(AI)抗体滴度等免疫性状关系，结果表明，不同免疫性状存在显著相关的优势SNPs单倍型。杨红洋等[23]研究了中药复方多糖对不同MHCB-LβII基因型鸡血清细胞因子质量浓度的影响，发现MHCB-LβII基因多态性使鸡血清细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α质量浓度产生差异。试验研究结果显示，同一剂量cCHMPS对不同基因型鸡淋巴细胞的IL-2、IL-4、IL-12 mRNA表达量不同，此研究结果与李福伟、李尚民、刘立波、杨红洋等[20-23]的究结果相一致，说明不同免疫能力存在个体水平上的差异。试验出现此结果的原因有可能是MHC II类分子对中药多糖的感知有一定浓度范围，BC基因型鸡对高剂量中药多糖产生免疫耐受，导致机体免疫效果低于低剂量的中药复方多糖。

但此次试验中，仅仅研究了京红 1 号蛋鸡，且鸡的数量及免疫相关指标均较少，要确定中药复方多糖最适免疫剂量的筛选是否受鸡基因多态性的影响，还需增加鸡的品种，扩大试验鸡的数量，增加体内、体外免疫指标，进行深入研究。

4 结 论

中药复方多糖能显著提高机体免疫力，且50 μg/mL中药复方多糖对AA、BC基因型鸡，100 μg/mL中药复方多糖对BB基因型鸡淋巴细胞的免疫效果显著，提示中药复方多糖的免疫增强作用有最适浓度且MHCB-LβII基因多态性可能影响中药复方多糖免疫增强作用的最佳剂量，从经济角度考虑，确定添加50 μg/mL的中药复方多糖组对鸡淋巴细胞的免疫效果最优。

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