新疆部分小麦材料淀粉品质基因等位变异的分子鉴定及其分布

哈力旦·依克热木，周安定，芦 静，曹俊梅，刘联正，张新忠

(新疆农业科学院粮食作物研究所，乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】小麦是新疆最主要的粮食作物之一，小麦粉的主要成分为淀粉，由直链和支链淀粉组成，二者的含量是影响小麦面条品质的重要因素之一[1-3]；Waxy蛋白亚基是通过对小麦籽粒中直链淀粉含量在一定程度上影响以面粉为原料面条的食品品质[4-6], 分析和鉴定Wx蛋白亚基在新疆现有小麦品种和骨干亲的分布规律，对选育和改良优质面条小麦品种具有重要意义。【前人研究进展】近年来淀粉特性与小麦面制品品质的关系已成为各国研究的热点领域之一[7-9]，国内外对小麦糯蛋白(Waxy蛋白)和糯基因(Waxy 基因)进行了一系列研究，普通小麦含有Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1 等3种 Wx 蛋白亚基，其基因分别位于染色体 7AS、4AL 和 7DS 上[10-12]，研究表明，Wx 蛋白缺失可降低小麦直链淀粉含量导致淀粉糊化和膨胀特性的改变影响面条品质[13-15]，缺失个别或全部Wx蛋白都会影响小麦籽粒的直链淀粉含量； 在3种Wx蛋白中，Wx-B1蛋白缺失(Wx-Blb)对直链淀粉合成的影响最大，Wx-A1蛋白缺失(Wx-Alb) 对直链淀粉合成的影响最小；缺失Wx-B1亚基的小麦品种的直链淀粉含量低具有良好的面条品质[16-17]。【本研究切入点】新疆是重要的小麦生产基地 ，新疆育种者主要以产量和蛋白品质为研究着眼点，几乎未对小麦的淀粉品质进行深入研究，因此对新疆小麦材料在Wx等位基因的变异与分布情况不甚清楚。但多数育种者对自己掌握的小麦种质资源的矮秆基因及组成类型尚不清楚，在小麦育种过程中，存在着一定的盲目性。利用已开发的Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1分子标记，对新疆小麦育种品种材料淀粉品质基因Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1进行鉴定和评价，了解和分析为新疆小麦品质资源中Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1的分布情况。【拟解决的关键问题】鉴定和评价新疆小麦品种材料中Wx基因类型，了解Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1的分布状况和变异类型，筛选出一些Wx基因缺失的育种材料，为该区选育优质面条小麦品种提供理论依据和快速有效的方法，为新疆选育优质面条小麦品种奠定基础。提高小麦淀粉品质评价和选育的效率。

1 材料与方法

1.1 材 料

所用小麦材料均来自新疆农业科学院粮食作物研究所小麦课题组，共169份，冬小麦品种75份，春小麦品种94份，其中新疆当地品种25份，其他国内内地品种46份，下同，国外品种98份。

1.2 方 法

1.2.1 基因组DNA提取

用CTAB方法，叶片(约1～2 g)充分研磨后分别放入2.0 mL离心管；加入1.0 mL CTAB提取液(20 g CTAB，1M Tris-HCl(pH 8.0)100 mL，0.5M EDTA(pH 8.0)100 mL，5 M NaCl 280 mL)，用蒸馏水定容至1 000 mL，灭菌后加 β-巯基乙醇至10 mM)，置于65℃水浴30 min,水浴过程中混匀数次；然后在4℃下12 000 r/min离心15 min；移上清至一新的2.0 mL离心管中，加入等体积的酚/氯仿(1∶1)，轻摇5～10 min；4℃下12 000 r/min，离心15 min；移上清至一新的1.5 mL离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，轻摇5～10 min；4℃下12 000 r/min，离心10 min；移上清至一新的1.5 mL离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇沉淀DNA，置于-20℃冰箱30 min；4℃下12 000 r/min，离心15 min，去上清，加0.5 mL乙醇(70%)，静置5 min；4℃下12 000 r/min，离心5 min，去乙醇(70%)，室温干燥后，溶于400 μL的1×TE中备用。

1.2.2 特异性分子标记引物序列(5’～3’)

利用刘迎春等[18]开发的Wx-A1，Wx-D1标记 F-5′CCAAAGCAAAGCAGGAAACC R-3′TACCTCGGAGATGACGCTGG、F-5′CGAGCGGCTACTCAAGAGC、R-3′GGCGGTCATCTGTCATTTCC Nakamura等[19]研发的Wx-B1标记 F-5′ CTGGCCTGCCTACCTCAAGAGCAACT ,

R- 3′ CTGACGTCCATGCCGTTGACGA。 PCR体系20 μL，含模版DNA 3 μL，TaqDNA polymerase(2.5 u/uL) 酶(北京天根生化科技公司)，上下游引物(5 μL/l)各1.0 μL，用ddH2O补充反应体系至20 μL。反应程序为：95℃预变性5 min，94°变性30 s，56°退火1 min，72°延伸1 min，35个循环，72℃延伸10 min；PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离，采用缓冲体系0.5×TBE溶液， 200 V电压电泳45 min，0.5%溴化乙锭(Ethidium bromide，EB)染色10 min，蒸馏水漂洗后在GelDoc XR System成像系统上用紫外灯扫描成像并存入计算机。分析特异性条带。

2 结果与分析

2.1 Wx-A1等位基因的类型分布

利用MAG264标记检测Wx-A1位点，可扩增获得2种片段，扩增出336 bp片段的为野生型Wx-A1a，扩增出317 bp片段的为突变型Wx-A1b；含有Wx-A1a基因的材料均能扩增出336 bp片段，含有Wx-A1b基因的扩增出317 bp的片段，扩增出条带清晰，以中国春为对照，重复性好。材料品种中Wx-A1a基因的频率为74.56%，Wx-A1a基因类型在国内品种占主位，频率为84.78%。Wx-A1b基因的频率为25.44%，在新疆品种占主位，频率为44%。表1，图1

注：M：DL 2000；1：新春34号；2：新春39号；3：新春14号；4：新春27号;5：新春41号;6：陇麦15号;7：苏麦3号;8:陇17号;9:dollar bird;10:阿夫;11:中国春

Note: M:DL2000; 1: Xinchun34; 2: Xinchun39; 3: Xinchun14; 4: Xinchun27; 5: Xinchun41; 6: Longmai15; 7: Sumai3; 8: Long17; 9: dollarbird; 10: Afu:; 11: Chinese spring

图1 特异性 PCR标记MAG264对供试材料的扩增结果
Fig.1 PCR products amplified by specific PCR labeled MAG264 tested materials

2.2 Wx-B1等位基因的类型分布

利用Nakamura开发的BDFL/BRD标记， 检测Wx-B1位点基因，携带Wx-B1a的材料能扩出425 bp的片段，为野生型，不携带此片段的类型属于Wx-B1b基因类型，为缺失突变型。对供试材料进行检测，有116份材料扩增出425 bp的片段，为Wx-B1a基因类型，频率为68.64%，Wx-B1a基因类型在国内品种占主位，频率为82.61%；Wx-B1b基因的频率为31.36%，在新疆品种与国外品种占主位。表1，图2

2.3 Wx-D1等位基因的类型分布

利用MAG269标记，检测Wx-D1等位基因。携带Wx-D1a的能扩出1 400 bp的片段，Wx-D1b类型的能扩出800 bp的片段。检测中，Wx-D1a基因类型的比例为95.27%，新疆品种与国外品种占主位。Wx-D1b基因类型的比例为4.73%，其他国内品种少部分带此基因。材料品种的大部分带Wx-D1a基因。表1，图3

注：M:DL 2000；1:巴丰5号;2:宁作6号;3:宁春37号:4:宁春4号；5：新冬12号；6：新冬16号；7：新冬2号:；8：中国春

Note: M:DL 2000; 1: Bafeng5; 2: Ningzuo6; 3: Ningchun37; 4: Ningchun4; 5: Xindong12; 6: Xindong16; 7: Xindong2; 8: Chinese spring

图2 特异性 PCR标记BDFL/BRD对供试材料的扩增结果
Fig.2 PCR products amplified by specific PCR labeled BDFL/BRD tested materials

注：M：DL 2000；1：农大311；2：中优9507；3:邯麦11；4:沧麦6002；5:新冬2号；6:新春13号；7:宁作6号；8:新春16号；9:敖德萨3号；10:中国春)

Note: M: DL 2000; 1: Nongda311; 2: Zhongyou9507; 3: Hanmai11; 4: Cangmai6002; 5: Xindong2; 6: Xinchun13; 7: Ningzuo6; 8: Xinchun16; 9: Aodesa3; 10: Chinese spring

图3 特异性 PCR标记MAG269对供试材料的扩增结果
Fig.3 PCR products amplified by specific PCR labeled MAG269 tested materials表1 供试材料在Wx相关基因标记的分布频率
Table 1 Allelic frequencies for Wx genes in the materials tested by molecular markers

来源Origin材料数AccessionnumberWx-A1a(%)Wx-A1b(%)Wx-B1a(%)Wx-B1b(%)Wx-D1a(%)Wx-D1b(%)新疆当地品种Xinjianglocalcultivars25564464361000其他国内品种OtherChinesecultivars46847815228261173982611739国外品种Overseacultivars9874492551632736731000合计Total16974562544686431369527473

2.4 冬春麦材料中Wx-A1、Wx-B1、Wx-D1基因类型的分布

在169份供试材料中，冬小麦75份，春小麦94份。Wx基因在冬春麦材料中分布不尽相同，缺失Wx-A1b基因类型在冬小麦材料中占18.67%，在春麦材料中占30.85%。缺失Wx-B1b基因类型在冬小麦材料中也是占18.67%，在春麦材料中占41.49%。缺失Wx-D1b基因类型在冬小麦材料中占10.67%，春麦材料中未检测出此基因。研究表明：冬春小麦材料中，缺失突变类型基因Wx-A1b和Wx-B1b以春麦为主占主位。可见，Wx基因的分布在冬春小麦材料中有一定的差异。图4

图4 冬、春小麦材料中Wx-A1、Wx-B1、Wx-D1基因分布
Fig.4 Frequency of Wx-A1、Wx-B1 and Wx-D1 genes in winter and spring wheat cultivars

3 讨 论

近年来，国内对于Wx蛋白基因类型的分布及淀粉特性进行了一定研究。研究表明，不同区域的小麦材料中，Wx蛋白亚基的类型和分布频率差异很大[20-23]，研究鉴定的结果与其一致。而有研究也表明在日本、土耳其等国小麦品种材料中，缺失Wx-A1蛋白亚基的频率较高，而在澳大利亚、意大利等国小麦品种材料中，Wx-B1蛋白亚基缺失的频率高[23-26]；李式昭等[27]对澳白麦的Wx基因进行了分析，在分析的小麦材料中Wx-B1缺失类型频率为63.9%；小麦材料中Wx蛋白亚基缺失体的淀粉特性平均表现总体优于非缺失体，澳白麦的优质面条品种都为Wx-B1蛋白亚基缺失类型[28]；对中国小麦材料的鉴定分析表明，则以Wx-B1蛋白亚基缺失为主，但Wx基因的缺失比例不高[23,25]。在研究中，小麦材料以Wx-B1蛋白亚基缺失为主，为31.67%，远低于澳白麦的缺失体比例；同时在鉴定材料中缺失Wx-A1、Wx-B1基因类型的品种有14份，其中4份为新疆品种，10份为国外品种, 同时缺失Wx-B1、Wx-D1基因类型的有3份，为国内品种，25份新疆当地品种中检测到11份Wx-A1缺失类型，9份缺失类型Wx-B1蛋白亚基的材料，新疆小麦材料未发现Wx-D1蛋白亚基缺失类型，同时还检测出8份不缺失Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1三种蛋白亚基的材料；说明研究检测的小麦材料尤其是新疆小麦材料有其丰富的基因资源和遗传多样性， 因此，在选育优质面条品种时要重视Wx蛋白亚基缺失的利用，来起到对新疆小麦品种淀粉糊化特性的改良。

新疆小麦材料中未检测出Wx-D1基因的突变类型。因Wx-D1基因的突变可以降低直链淀粉含量，可以提高膨胀体积、峰值粘度、进而改进面条的品质；而对研究筛选到的材料，还需做进一步淀粉特性的评价和研究，以了解其淀粉品质表现，才能在糯性小麦育种中加以利用而提高选育效率。因此，在今后的小麦育种中，需要重视Waxy蛋白亚基的的引进与利用，提高新疆材料中的Waxy蛋白亚基基因的突变类型，选育出优质的、适合于加工面条的优质小麦品种。

4 结 论

在冬、春小麦含有Wx-A1、Wx-B1、Wx-D1基因类型分布率有一定的差异。春麦Wx-A1基因突变类型的比例为30.85%，Wx-B1基因的突变类型比例为41.49%。冬麦的Wx-A1基因野生型突变型为18.67%，低于春麦。从小麦材料来源来看，新疆当地品种的突变类型往往高于国内、国外品种，含有Wx-A1、Wx-B1基因突变类型的比例分别为44%、36%，突变类型中占主位，表明新疆小麦的淀粉品质良好。

新疆品种的缺失Wx-A1、Wx-B1、Wx-D1亚基突变频率基本上高于其他地区的品种材料，在Waxy蛋白位点展示了独特性，具有较为丰富的遗传多样性。Waxy蛋白亚基缺失的频率大大增加，可筛选出各种变异类型，同时明确新疆小麦材料淀粉品质基因类型，有助于提高优质面条品质的选择效率。

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