预防与治疗性结核病疫苗的研究进展

张智芳， 严延生

结核病(TB)在过去200年已造成10亿人死亡[1]，是世界十大死因之一 。世界卫生组织(WHO)2017年最新报告，2015年全球发生1 040万例结核病例，已达到警戒线；2017年有170万人死于TB。TB的主要危险因素包括贫穷、居住过度拥挤、营养不良、酗酒和艾滋病毒感染等。由结核分枝杆菌(MTB)引起的多数感染是无症状感染，约只有12%的感染最终发展为活动性TB患者[2-3]。WHO期望在2035年终止TB流行，发病率和死亡率分别要降90%、95%。这就需要有敏感易用的检测手段、治疗有效且时短的药物，而且要有比目前卡介苗(BCG)更为有效的预防性疫苗[4]。

2001年之前，结核菌素皮试是TB实验室诊断的唯一方法。但在2000年后，有2种IFN-γ释放试验(IFN-γ release assays，IGRAs) 经美国食品药品监督管理局(FDA)的批准应用于TB实验室诊断。该检测所用的IFN-γ是由ESAT-6抗原刺激产生的。首先批准的QuantiFERON-TB Gold In-Tube检测方法，只是测定ESAT-6、CFP-10和TB7.7刺激后分泌到外周血中的IFN-γ的浓度[5]；第二个经许可的IGRA则是T-Spot.TB测定，它用全血分离外周血单核细胞进行[6]。首先从血样中提取外周血单核细胞并将其与ESAT-6和CFP-10混合，经刺激后的单核细胞加入到包被有鼠抗人的IFN-γ上，洗涤去未结合的单核细胞等，再加入酶标记系统，就可检测分泌IFN-γ的细胞数。

由于治疗和管理问题，耐多药结核病(MDR-TB)患者日益增多。原为治疗TB有效的异烟肼和利福平，对MDR-TB患者治疗基本上已无效[7]。新的抗TB药物的研究正在进行中，目前已进行Bedaquiline(Sirturo)，Janssen，Titusville和delamanid(Deltyba)等MDR-TB治疗方法的研究，现已有利奈唑和伊马替尼等MDR-TB治疗药物[8-11]。

BCG的亲本株为牛型分枝杆菌，经实验室多代培养，在丢失了编码毒力因子的RD1区后成为减毒活疫苗。1921年，法国开始使用BCG作为结核病预防性疫苗，此后逐渐延伸到全球使用。迄今为止BCG是唯一获得许可使用的疫苗[12]。虽然接种BCG可预防儿童结核性脑膜炎和播散性结核病，但不能预防成年人感染MTB，因此，研制新型的预防性和治疗性TB疫苗是必要的。

目前研制的TB疫苗有预防和治疗性两类疫苗，以前者为多。MTB感染主要引起细胞性免疫应答，而接种BCG只能预防儿童TB。为了延长细胞免疫的效果，新研制的预防性疫苗包括了基础免疫和增强免疫两部分内容。本综述对基础性疫苗、增强性疫苗、治疗性疫苗以及疫苗佐剂的研究进展进行了分析，并对结核疫苗的研究进行了展望。

1 基础性免疫疫苗

基础免疫是指人体初次接受某种疫苗全程足量的预防接种，是一种打好基础的有效免疫，但由于各种疫苗的性质不同，基础免疫的次数和剂量也各不相同，一般是根据儿童免疫的规划史来介定疫苗的基础免疫。BCG则是基础性疫苗的典型代表。现已研发出VPM1002和MTBVAC苗作为基础性免疫疫苗，研究认为这2种苗可以替代BCG。

1.1VPM 1002 VPM 1002 (rBCGΔUREC∷HLY)是BCG的一个重组株，该株系用单核细胞李斯特菌毒素O(HLY)基因取代BCG的尿素酶C基因[13-14]，BCG尿素酶的产氨作用抑制了自噬体的成熟而有利于MTB在胞内的存活，而HLY取代了尿素酶C基因可快速酸化胞内环境促进自噬体的成熟；另一方面HLY还可产生溶细胞毒素蛋白[15]，使rBCG抗原及DNA暴露于胞浆中而迅速被降解，此过程通过MHCⅠ类通路增强了T细胞免疫反应，进一步激活炎症小体、启动细胞的自噬和凋亡[16-17]。已经进行了VPM1002替代BCG并预防成人活动性肺结核复发的评价[14]。在德国进行两期I期临床试验(NCT 00749034，NCT 01113281)验证了该苗在欧洲裔健康成人中使用是安全的；此外，疫苗的稳定性和免疫原性在南非的I期临床试验(NCT 01113281)中得到确认；用48例新生儿所进行Ⅱ期临床试验NCT01479972)也证实VPM1002具有安全、耐受性和免疫原性好的效果[15]。由于VPM1002在动物模型中的效果仍有争议，因此又研发出VPM1002的改进型(rBCG ΔureC::hly ΔnuoG)，nuoG编码NADH-醌氧化还原酶参与分枝菌的呼吸，尽管有这些改进，但VPM1002在Ⅰ、Ⅱ期临床试验中的结果不可否定，仍认为该苗有可能取代BCG，因此Ⅲ期临床试验将在印度进行。

1.2MTBVAC MTBVAC (ΔPhoPΔfadD26)是一种毒力相关基因缺陷减毒的活细胞苗，这是首个直接用MTB减毒的活苗。2个毒力相关PHOP/PHOR基因的缺失，涉及到MTB转录系统部分功能丧失，影响到含有大多数MTB毒力因子存在的2%基因组，其结果使MTB的致病力下降；FADD26基因系表达MTB细胞壁上巯基乙酸二菌酯酶，它的缺失也造成MTB无法合成细胞壁脂类，影响到MTB在细胞内的存活[16]。MTBVAC苗的母本株来源于流行最为广泛的北京系株，且其免疫效果在于抗原性的增加.主要表现在虽然RD1区缺失，但ESAT6 和 CFP10这两个拥有多数T细胞表位具有很强免疫原性的蛋白抗原仍然存在并发挥功能作用，此外也由于抑制了非编码RNA MCR7而导致Ag85复合物蛋白增加分泌的结果[17]，所有这些抗原性增加的特征使该候选苗优于BCG。大鼠和豚鼠的临床前试验表明，MTBVAC是安全和具有免疫原性的疫苗。重要的是 Ⅱ期临床试验及2017年2月完成的MTBVAC与BCG疫苗比较的临床试验，也显示了该苗具有很好的安全性和免疫原性。因此该苗也被认为有可能替代BCG作为新生儿免疫苗，其次可作为预防青少年及成人感染TB用苗。

2 增强性免疫疫苗

增强性免疫一般是在基础免疫后为增强相应的免疫应答，通过再次接种疫苗刺激机体产生免疫应答，使抗体或细胞免疫维持在足以抵抗病原体的水平。增强性免疫是用来预防潜在的TB感染，接种对象为出生后已接种过BCG或其替代苗的青少年和成人。增强性苗主要有3类，分别是亚单位疫苗、病毒载体疫苗或全细胞疫苗。目前已经研发的并进行了临床试验的6种亚单位疫苗：Hybrid 1-IC31,Hybrid 1-CAF01,H56:IC31,H4 (HyVac4),M72,and ID93； 3种病毒载体疫苗：MVA85A、Ad35/Aeras402和Ad5-Ag85A；1种全细胞疫苗：DAR-901。

2.1 相关抗原

2.1.1Ag85A、 Ag85B和Ag85C Ag85是一类蛋白复合体，由Ag85A、 Ag85B和Ag85C 3种组分组成，分子大小为30～31 kD不等，属于早期分泌蛋白，由MTB的TAT分泌系统产生，受非编码RNA mcr7表达的影响，在BCG中该蛋白复合体基因缺失。这3个组分是由3个不同基因位点编码而成，在基因和氨基酸序列上同源性很高。但在不同株中，其表达的免疫原性有差别；在MVA85A疫苗与 BCG比较的II b期临床试验中显示MVA85A疫苗无保护作用，认为Ag85A只产生了微弱的T细胞免疫应答；在MTB H37Rv株中，Ag85A、Ag85B和Ag85C的T细胞表位分别是79、86和5个， Ag85BT细胞表位的占比为5.36%，可见 Ag85B T细胞表位多于其他两种，在MTBVAC苗中，Ag85B 也可高度表达[18]，细胞免疫反应强，研究表明Ag85B参与脂质的积累和储存，是MTB潜伏期间所必须的一个重要抗原。

2.1.2Rv2660 Rv2660是一类属于MTB RD11区编码蛋白的核苷酸序列，其蛋白具体功能有待确认。但在营养缺乏的培养中，该类基因表达上调，而且在“MTB饥饿模型”，也检测到微弱表达的Rv2660抗原蛋白，表明该蛋白与MTB的“饥饿刺激”有关；与活动性感染不同，在隐匿性肉芽肿性病变的患者中也发现该基因表达上调，推测Rv2660与MTB的隐秘性感染有关。因此将其视为具有激活隐秘性感染细胞免疫作用，与产生强烈细胞免疫的基因融合构建新的免疫加强疫苗。 Rv2660c在不同遗传种系的流行株中核苷酸序列基本一致，因此它表达的部分融合疫苗蛋白抗原，有助于抗潜伏性感染[19]。

2.1.3ESAT-6 和CFP-10，TB 10.4 分子量为6 kD的早期分泌靶抗原(early secreted antigenic target of 6 kD,ESAT-6)和分子量为10 kD的培养滤液蛋白( culture filtrate protein of 10 kD,CFP-10)是一组被认为是MTB培养滤液中最具免疫原性的蛋白，二者均为分泌性抗原，由MTB 基因组的RD1区编码表达，形成1∶1分子配置且相互依赖的异二聚体复合物，CFP-10 C末端信号肽序列负责该复合物经由ESX-1系统分泌，使其在MTB的感染毒力方面起重要作用[20]。研究还发现，ESAT-6可与TLR2启动巨噬细胞内TLR信号通路，通过激活Akt抑制吞噬细胞连接蛋白MyD88与IRAI}4激酶的相互作用，下调核转录因子NF-KB以及干扰素调节因子IRFs的表达，从而有利于MTB在细胞内的存活。ESAT-6和CFP-10编码的基因高度保守，但在BCG中都缺失，只在MTB中表达产生，且在MTB的增殖期和非增殖期均有高水平的转录和表达，对小鼠和人类均具有很强的免疫原性，多种预防性疫苗都用到ESAT-6蛋白抗原，但其诱导产生强大的免疫应答需要使用佐剂来增加保护性[21]。TB 10.4与ESAT-6有10%～35%的同源性，属于ESAT-6基因家族。TB 10.4含有多个抗原表位，能诱导小鼠产生特异性细胞毒性T淋巴细胞。

2.1.4MTB32A和MTB39A MTB32A和MTB39A蛋白抗原分别由Rv0125 and Rv1196编码，它们核苷酸序列在引发TB的绝大多数MTB致病株中都很保守，弱毒株H37Ra也存在这一序列。MTB39A对MTB32A的核苷酸序列符合率 ≥98 %，主要表现在重复区单核苷酸残基的插入或缺少；由这些抗原构成的候选苗在欧、美和亚非人群均能引起CD4+T细胞的免疫应答[22]。

2.1.5Rv1813,Rv2608,Rv3619,and Rv3620 Rv1813,Rv2608,Rv3619,and Rv3620为融合蛋白，均属于PE / PPE家族，这一家族约占MTB编码蛋白的10%，因蛋白的N一端富含脯氨酸一谷氨酸(PE)、脯氨酸一脯氨酸一谷氨酸(PPE)而得名，其功能主要与免疫调节有关，参与MTB的致病作用，与 ESX-1分泌系统的功能有类似之处，但位于ESX-5分泌系统。 该家族成员N-末端保守，C-末端差异，因此构成不同成员[23]。

2.2亚单位疫苗 亚单位疫苗，即通过化学分解或有控制性的蛋白质水解方法，提取细菌、病毒的特殊蛋白质结构，筛选出的具有免疫活性的片段制成的疫苗。亚单位疫苗是将致病菌主要的保护性免疫原存在的组分制成的疫苗，也叫组分疫苗。亚单位疫苗仅有几种主要表面蛋白质，避免产生许多无关抗原诱发的抗体，从而减少疫苗的副反应和疫苗引起的相关疾病。亚单位疫苗的不足之处是免疫原性较低，需与佐剂合用才能产生好的免疫效果。

van Disse等首先进行了含有Ag85B和ESAT-6融合蛋白抗原并以IC31为佐剂的Hybrid 1-IC31疫苗的I期临床试验(NCT 01049282)，48例志愿者在0和2个月分别接种该疫苗一次，在48例志愿者中只有1例表现轻微的副反应，其他多数在注射部位呈现一过性的红肿或疼痛，显示该融合蛋白苗具有良好的耐受性和安全性；不管志愿者是否感染MTB，它均可诱导长寿命的CD4 T细胞反应，从而在志愿者中产生TNF-α和白细胞介素2(IL-2)[24]。此外，在南非进行的Ⅱ期临床试验 (PACTR 201403000464306)中，显示在非感染人群 (QFT阴性) 与感染MTB的青少年 (240名QFT阳性) 中该苗稳定且具有免疫原性[25]。特别是在非洲一些国家,泛非卫生组织用Hybrid 1-IC31苗进行的Ⅱ期临床试验(PACTR201105000289276)，证实其可用于保护已经感染HIV且CD4淋巴细胞计数大于350个/mm3的成人[26]。

与Hybrid 1-IC3亚单位疫苗相同的是,Hybrid 1-CAF01疫苗也是由Ag85B和ESAT-6融合蛋白抗原组成，所不同的是其以脂质体CAF01为佐剂，该Ⅰ期临床试验(NCT 00922363)分4组进行，目的要证明该新型脂质体佐剂CAF01安全性和耐受性。其中1组不加佐剂，另3组使用，佐剂剂量依次提高；该苗仍然表现融合蛋白抗原具有免疫原性和安全性，佐剂组受试者T细胞免疫应答时间延长(随访持续150周)，除产生 Th1免疫应答诱发的INF-γ外，还产生TNF-α， INF-γ-γ诱导的蛋白10，单核细胞因子等；证实使用CAF01佐剂能提高受试者的细胞免疫应答，且具有良好的安全性和耐受性[24]。

美国Rockville与美国全球结核病疫苗基金会(Aeras)协作开发了针对青少年及成人TB预防的 H56(原为AERAS-456):IC31苗，该苗由Ag85B、ESAT-6和Rv2660C融合蛋白抗原组成，以IC31为佐剂。H56：IC31设计作为TB基础疫苗免疫后的增强疫苗，佐剂加量的Ⅰ期临床试验(NCT067134)在24名HIV阴性患者中进行，试验显示该疫苗安全性和耐受性良好，并且证实高剂量IC31佐剂不会引起不良反应[27]，提示了IC31作为佐剂的安全性。

HyVac4(H4)是由丹麦国立血清研究所(the State Serum Institute，SSI)研发的候选疫苗。该苗以Ag85B和TB10.4为抗原，以IC31为佐剂。在BCG接种的基础上，用HyVac4苗增强免疫使豚鼠产生了对TB10.4特异性的IFN-γ+TNF-α+IL-2+或TNF-α+IL-2+CD4+T细胞免疫应答；HyVac4：IC31在豚鼠中的免疫原性要优于单用BCG接种，表现出基础-增强免疫策略的良好效果[28-29]。佐剂剂量提升的2个Ⅰ期临床试验 (NCT 02066428和NCT 02074956)已经分别在欧洲和南非接种BCG的成年人组中完成；此外，在南非还进行了产生多功能CD4+T细胞的免疫应答和稳定性的Ⅱ期临床试验(NCT 02075203)[30]。M72是葛兰素史克公司和Aeras联合开发的一种72 kDa多聚蛋白苗，所使用的抗原是结核分枝杆菌MTB32A和MTB39A的融合蛋白，以AS01E为佐剂。目前，M72的Ⅱb期临床试验 (TB-018) (NCT 00950612)计划在2个非洲国家(南非和肯尼亚)的 3 000多名成人病人中进行[31]。

ID93是由4种MTB抗原Rv 2608、Rv 3619、Rv 3620及潜伏期相关蛋白Rv 1813组成的重组融合蛋白，以葡萄糖吡喃脂乳剂(GLA-SE) 为佐剂形成TLR类似物并辅助诱导产生强烈的Th1免疫应答。该苗在有BCG和无BCG接种的小鼠和豚鼠动物试验中，均能产生多功能的IFN-γ+TNF-α+IL-2+ 和CD4+T细胞，达到了诱导Th1免疫反应的预期效果。ID93也可以用于免疫治疗。在小鼠和食蟹猴中比较ID93添加利福平或异烟肼的临床前研究表明，ID93可诱导多能抗原-特异性Th1免疫应答及抑制MTB诱导的肺病理改变[32]。已经完成了一项由美国华盛顿西雅图传染病研究所赞助的在成人TB患者中进行随机、双盲和安慰剂对照的Ⅱa期临床试验(NCT 02465216)，证实ID93苗同时具有治疗性价值。

2.3病毒载体疫苗 病毒载体疫苗，是以病毒作载体表达外源免疫原基因的疫苗。如MVA85A,Crucell Ad35/Aeras402,Ad5-Ag85A已被开发成加强性疫苗。

MVA85A是一种表达Ag85A改良的安卡拉痘病毒增强疫苗。未见该苗在南非进行的用BCG接种的儿童(2013年)和已感染HIV成人受试者(2015年)中的增强免疫与对照组的比较有统计学显著性差异的结果[33]；此外，MVA85A作为加强免疫苗的一Ⅱb临床试验显示，其抗MTB感染作用与对照组比较也没有显著性差异[34]，目前已不研究该苗的增强免疫作用；经由气溶胶途径的Ⅰ期临床实验(NCT01497769)证明该菌具有特异性粘膜的系统性细胞免疫作用[35]。

荷兰库瑟公司(Crucell)和Aeras联合开发的 Ad35/AERAS-402疫苗使用复制缺陷型35型腺病毒为载体，表达Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原。由Aeras赞助的Ⅱb临床试验 (NCT 02414828)显示该苗对近期或过往的肺结核有强烈的细胞免疫应答，同时证明用Ad35/AERAS-402治疗与肺部并发症无关[36]。

2.4全细胞疫苗 DAR-901是美国Dartmouth大学研制的一种全细胞疫苗。它是一种以Obuense分枝杆菌为基础的热灭活疫苗，与MTB共有多种抗原成分，具有交叉保护作用。该疫苗是为接受BCG免疫的HIV感染者和未感染HIV的儿童和青少年研制的一种增强性疫苗[37]，Ⅰ期临床试验 (NCT 02063555)对77名接种BCG的HIV阴性和HIV阳性成人进行，证实该苗具有良好的安全性、耐受性和免疫原性。近期由Dartmouth-Hitchcock医疗中心赞助进行的Ⅱ期临床试验(NCT 02712424)，受试者主要由接受BCG治疗的坦桑尼亚青少年组成，其目的要确定实验组是否降低了TB感染的风险；也进行了Ⅲ期临床试验，受试者为HIV感染者，在接受了多次该苗的增强免疫后，已证实该试验的实验组与对照组具有统计学意义，即说明用该苗可保护HIV感染者不再受TB感染[38]。

2.5增强疫苗性能的佐剂 IC31由免疫刺激剂TLR(toll样受体)9配体(ODN1a，一种寡脱氧核苷酸)和合成抗菌肽(H-KLKL5KLK-OH)组成，作为H4和H56疫苗佐剂[39]。AS01含有TLR4配体3-O-去酰基-4’-单磷酰脂A(MPL)和皂甙衍生物QS-21作为脂质体佐剂[40-41]，AS01E也是一种佐剂，它可以降低由AS01引起的强烈的细胞免疫应答以适合多数疫苗使用，目前该佐剂被用于M72疫苗。AS02 是含有 MPL 和QS-21 的水包油乳化剂，而不是脂质体佐剂[42]。CAF01是以DDA 脂质体 (N，N’-二甲基-N，N’-双十八烷基铵)和合成的α分枝杆菌免疫调节剂(α’-海藻糖6，6’-二硼酸酯(TDB))按5∶1比 例[43]配制而成，它被用于H1疫苗。GLA-SE是一种稳定的乳浊剂，由合成的TLR 4配体葡萄糖吡喃脂佐剂组成，用于ID93疫苗[44]。

3 TB治疗性疫苗

治疗性疫苗是指在已感染病原微生物或已患有某些疾病的机体中，通过诱导特异性的免疫应答，达到治疗或防止疾病恶化的天然、人工合成或用基因重组技术表达的产品或制品。其优点是治疗性TB疫苗与现有药物一起使用时可以缩短TB治疗的周期，目前主要有以下2种。

3.1Ruti疫苗 Ruti疫苗主要用灭活的MTB全部碎片组分去除毒素后包裹在脂质体内构建而成，最早是西班牙一种免疫治疗用苗。Ruti可用于治疗潜伏性TB感染。Ⅰ期临床试验已显示该苗是安全的并可诱导加强健康个体的免疫应答，具有很好地预防MTB感染的效果。Ⅱ期临床试验进一步证实该苗对共感染HIV的TB患者安全、耐受和具有很好的免疫原性，是一种免疫治疗剂[45]。对于HIV感染严重的非洲地区来说，这种免疫治疗是很有意义的。

3.2SRL-172疫苗 SRL-172疫苗是由安徽合肥市龙城生物制药有限公司研制的一种疫苗。它由热灭活的Mycobacterium vaccae组成，并已被批准用于辅助治疗MTB患者[46]，Ⅲ期临床试验已经在HIV合并感染的患者中完成，也已经在结核菌素皮试为阳性的TB患者中进行了稳定性和有效性的临床试验(NCT 01979900)。

Ad5-Ag85A疫苗是用非复制的5型腺病毒为载体表达 Ag85A构建。在一项临床前的研究中表明，Ad5-Ag85A作为治疗性疫苗，可大幅提高BCG初免后肺部再感染MTB的豚鼠长期存活率[47]。此外，由McMaster大学赞助的Ⅰ期临床试验(NCT 00800670),证实该疫苗具有安全性及免疫原性[48]，病毒载体疫苗仍在开发中。但其他研究认为这类疫苗有缺陷，关键在于人和动物对Ad5腺病毒易感，体内Ad5腺病毒抗体滴度高很容易使该苗无效，用该载体作为HIV疫苗已证实存在这个问题[45]。

4 展 望

BCG接种婴儿对抗TB感染有效，但持续性约只有10～15年[49],再用BCG加强免疫也无法诱导有效的免疫应答[50]，这也是造成MDR-TB等复杂因素产生的原因，与目前全球TB的发病率、活动性TB的死亡率下降缓慢不无关系。多国在TB防治的研究上投入很大，也有不少TB疫苗的临床试验；我国是22个TB高负担国之一，TB感染的绝对人数紧随印度、印度尼西亚之后为全球第三大国；自2008年起，我国在“十一五”和“十二五”中设艾滋病、结核病重大科技专项试图在这两病的研究中取得突破性进展；在此项目影响下，复旦大学构建了多株重组BCG疫苗，如rBCG∶∶Ag85B-Rv3425,四川大学构建了多基因重组BCG，华中科技大学也构建了可显著增强BCG效果的rBCG∶∶AB的重组疫苗株[51]，还有许多成果在此不一一列举，但这些成果除少数外在总体水平上与发达国家的研究仍有差距。

目前列举在本综述中3大类13种疫苗及免疫策略各有特色，给TB的有效防治带来了希望，特别是在BCG的基础上研制的重组VPM1002 (rBCGΔUREC∷HLY)和MTBVAC等苗已完成了Ⅱ期临床试验或已进入Ⅲ期临床试验，有望取代BCG苗成为基础性疫苗。在增强免疫方面，亚单位苗和全细胞苗表现出强劲的增强细胞性免疫应答作用，包括HIV感染者也不例外，这说明基础-增强免疫策略对于预防TB感染是可行的。治疗性疫苗与有效抗MDR-TB药物的叠加，可有效地缩短治疗时限。对于目前TB感染和防控的现状，需要进一步加强对MTB感染和抗MDR-TB的基础研究，积极研制新型治疗MDR-TB患者的药物，尽快选定替代BCG疫苗及免疫策略，并加强对TB的管理，只有这样，才能最终实现WHO终止TB流行的目标。