H7N9禽流感病毒疫苗及其预防控制Vaccine, prevention and control of H7N9 avian influenza virus



H7N9禽流感病毒疫苗及其预防控制Vaccine, prevention and control of H7N9 avian influenza virus

刘倩(LIU Qian)，陈复辉(CHEN Fu-hui)

(哈尔滨医科大学第二附属医院，黑龙江 哈尔滨150006)

(The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University， Harbin 150006，China)

[关键词]H7N9； 禽流感病毒； 疫苗； 预防； 保护性抗体； 免疫原性

禽流感病毒有6个内部基因来自于H9N2，部分血凝素(hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(neuramidinase，NA)基因源自H7N3和H1N9。禽流感病毒能够感染人类，可能与HA和NA基因发生了Q226L和E627K关键位点突变有关，这两个突变被认为是病毒适应人类气道上皮的表现。此外，H7N9具有哺乳动物流感病毒的特性，如HA蛋白与哺乳动物细胞器结合，PB2蛋白基因突变等[1]。人类感染后缺乏特异性临床表现，很难早期诊断，患者死亡的原因多为多器官功能衰竭综合征和单纯急性呼吸衰竭。虽然临床观察认为神经氨酸酶抑制剂可能具有抑制H7N9病毒复制的能力，但是目前无大规模临床资料证实其疗效确切。本文就人感染禽病毒疫苗及预防控制的研究作一综述。

1H7亚型禽流感病毒暴发情况

自1959年起，H7亚型禽流感病毒引发多次暴发流行[2]。2003年荷兰禽类养殖场86例感染H7N7禽流感病毒，其中1例死亡[3]。 2012年墨西哥有2例确诊感染H7N3禽流感病毒[4]，2013—2014年我国共有375例确诊感染H7N9禽流感病毒，其中115例死亡，据统计，住院患者病死率为37%[5]，估计实际可能有27 000例感染。男性感染率及病死率均高于女性，高龄及患有基础疾病是增加病死率的危险因素[6]。

2H7N9禽流感病毒的人际传播

2.1人际传播的可能性H7N9禽流感病毒感染在我国暴发。据文献[7]报道，医务人员感染率比普通人高，上海有2个家庭出现家庭成员同时被感染，很可能由家庭成员互相传染导致，同时，哺乳动物可以互相感染。此外，研究[8]发现，新型H7N9禽流感病毒的HA与NA基因片段上的若干氨基酸替换后，可以和人受体α-2，6Gal及α-2，3Gal 结合，打破了病毒跨种属感染的障碍。由于病毒变异的时间、空间及方向均不确定，因此不能排除人感染人的可能性。

2.2可能存在的传播途径飞沫传播是目前研究的热点，徐晓龙等[9]从人体分离到的病毒株感染小鼠后小鼠的体重明显减轻，部分病毒株可以通过飞沫引起雪貂之间的传播，而雪貂对流感病毒的易感性与人类接近。目前已经检测到关键位点E627K和Q226L的氨基酸突变，若病毒在变异过程中出现更多关键氨基酸位点突变，则哺乳动物之间通过飞沫传播的可能性将会大大增加[7]。但是，目前实验证明病毒在雪貂之间传播的可能性有限[10]。研究结果显示，小白鼠被感染后其眼睛、咽分泌物、粪便均具有感染性[11]，其中咽部分泌物的感染性最高，提示存在飞沫传播的可能性。

2.3危害人际传播可能导致全球大流行，但是疫苗的研究需数月之久，在获得疫苗之前可能已有数百万人丧生[12]。

3传统季节性流感裂解疫苗新用法

2010—2011年香港老年人全病因所致病死率和肺炎所致病死率监测结果显示：接种季节性流感疫苗能显著降低病死率。该疫苗具有良好的安全性，诱导分泌的保护性抗体滴度高于欧盟标准，可以促使人体生成记忆B细胞，且免疫记忆可以保持若干年，再次感染后，体内能够分泌大量保护性抗体。但是，该疫苗对H7N9禽流感病毒的交叉免疫反应微弱，不能用于预防该病毒感染[13]。有学者尝试在季节性流感裂解疫苗中加入适量的佐剂MF59，结果诱导分泌的抗体滴度将明显增加，62%受试者的抗体滴度≥40[5]。通常认为血凝抑制抗体滴度≥40有预防感染的作用。与不加佐剂相比，达到相同滴度需要接种疫苗的剂量明显减少。这种剂量减少效应说明该疫苗有潜在的保护作用。而且加入佐剂后，B细胞和T细胞的数量明显提高，再次接种后能够快速分泌血凝抑制抗体[5]。已有证据[13]表明，H5N1裂解疫苗混合MF59后效果增强。1997年欧洲已经允许MF59作为佐剂加入季节性裂解疫苗，在此之后，全世界共有约65 000 000人接种，调查显示安全性良好[14]。

4新型疫苗的研究现状

4.1减毒活疫苗即毒性亚单位结构改变，毒性减弱，活性不变，保持抗原性的一类疫苗。H7N9-LAIV疫苗(H7N9-LAIVc)，是人工合成的包含H7N9病毒HA及NA基因片段和6个A/Ruerto/Rico/8/34病毒基因片段的基因重组序列，即重组病毒PR8基因片段，是一种减毒活疫苗。 H7N9-LAIVc具有良好的免疫原性和抗原性，并且小剂量接种即可诱导生成足够的保护性抗体[1]。HA基因氨基酸位点N133D、G198E突变使得基因复制大量增加，疫苗产量可增加10倍。研究[15-16]证明，H7N9-LAIVc疫苗对H7N3、H7N7有交叉免疫原性，因此推测其对同源和异源H7亚型禽流感病毒均具有免疫原性，为H7-LAIVc的研究提供了理论基础。

4.2正痘病毒(MVA)相关性H7N9禽流感病毒DNA疫苗(MVA-H7)和H7HA DNA疫苗(pH7HA)

4.2.1MVA-H7MVA是一种高度减毒、有复制缺陷、具有良好的生物学和遗传学特性的病毒，MVA已经作为病毒载体用于大量生产天花疫苗。将包含限制位点HPaI和NOtI的H7-sh2基因序列克隆转化到MVA的载体质粒，以mCherry作为标记基因，人工合成PMK IIIred-H7基因重组序列，然后去除mCherry基因，获得MVA- H7-sh2序列，即MVA-H7[17]。实验表明，IgA为保护性抗体，其滴度≥40。H7亚型交叉免疫能够检测到反应性抗体，疫苗接种后呼吸道内病毒复制明显减少[17]。同类的MVA-H5疫苗的安全性和免疫原性可靠，已经进入Ⅰ期临床实验阶段[18]，小剂量接种即可达到保护目的。H7-sh2取自A/Shanghai/2/2013病毒HA基因，该核苷酸序列足够用于建立一个病毒基因库，相关技术成熟，可以支持疫苗快速批量生产。

4.2.2pH7HA利用密码子优化技术获得H7HA基因序列，在巨细胞病毒立早启动子的控制下，将H7HA克隆到PGX0001质粒，得到目的核苷酸序列，即pH7HA该疫苗诱导分泌的血凝抑制抗体(HAI)是主要的保护性抗体，经检测发现抗体滴度可达到保护剂量。同样方法合成的HPV E6/E7 DNA疫苗可以诱导生成足量抗-HPV抗体，且其高滴度维持6个月不下降[19]。除了体液免疫外，pH7HA还促使发生细胞免疫，特异性CD8T细胞分泌的IFN-γ和CD-107a较未免疫者明显增加。CD8T细胞使被病毒感染的细胞裂解，从而将其清除，同时在CD4T细胞的协助下保持免疫记忆,CD4T细胞还会帮助B细胞分泌抗体。从检测到病原体，到大量生产疫苗只需要数月[19]。因此pH7HA有希望应用于预防H7N9禽流感病毒大流行。

4.3病毒样颗粒疫苗(VLP疫苗)H7N9禽流感病毒的HA和NA基因及H5N1的基质蛋白(M1)基因克隆到杆状病毒载体，导入SF9细胞后自行组装成H7N9病毒样颗粒，即病毒样颗粒疫苗(H7N9-VLP)。目前起保护性的抗体尚未明确，可能是IgG或IgM，也可能两者都是[20]。人类接受重组禽流感病毒疫苗H5N1-VLP免疫后，H5N1感染发病率明显降低，但该疫苗对H7N9易感人群无保护作用，H7N3-VLP可对同源的H7N9表现出交叉免疫作用。

5预防和控制H7N9禽流感病毒

5.1控制活禽市场该病毒的传染源不明确，80%的患者有直接或间接的禽类接触史，怀疑传染源和环境污染有关，如污水和禽类粪便[21]。调查[21]显示，关闭活禽市场可以降低感染率，然而在文化水平较低的地区这一举措所起作用不大。捕杀被感染的禽类和给予易感染的禽类接种疫苗也能够降低感染率。

5.2加强公共场所管理公共场所人口密集，流动性大，是呼吸道传染病传播的主要场所。必须建立健全组织规章制度，提高卫生质量，如环境卫生、饮食及饮水卫生、公共设施卫生和个人卫生等。加强消毒管理，落实消毒措施，完善卫生监督、监测管理制度，一旦发现感染患者立即向有关部分报告，同时将患者送往定点医疗机构治疗。

5.3规范医院管理制度包括对医务工作者及患者的管理。工作过程中医护人员，尤其是护士不可避免与患者近距离接触，甚至会接触到患者的分泌物，增加了感染的概率。医护工作者在进出隔离区时必须做好自身的消毒工作，按规定戴好帽子、口罩，穿脱隔离衣，避免将病毒带出隔离区。医院有义务设立专门的诊室和病区，患者和疑似感染者分室隔离，减少互相传染的机会，处理好被隔离人员的饮食住宿及家属探视问题。

5.4传染病相关知识的宣传教育相关部门需积极组织宣传传染病相关知识，让更多的人知晓其危害，主动做好自身防护,提高人们对H7N9的认识程度对遏制其传播有重要意义。2003年初SARS突降人类时，我们对其一无所知，随着SARS防控知识的宣传及健康教育举措的实施，人们逐渐认识了此病，并养成了良好的个人习惯，如保持居室自然通风、不去人群密集的场所、佩戴口罩、勤洗手、增加营养和户外活动等，在切断传染途径这一环节起了重要作用。

5.5及时发现并治愈患者患者缺乏特异性临床表现，实验室和影像学检查，几乎所有入院患者的临床表现与肺炎一致，主要为疲劳、发热、咳嗽、肌肉酸痛、腹泻。重症者可能出现意识错乱、呼吸急促。某些轻症者缺乏呼吸道症状。据统计H7N9禽病毒感染的住院患者53%谷丙转氨酶(ALT)、73%谷草转氨酶(AST)、47%血糖、93%CRP高于正常，33%出现低血钾[22]，肺部CT可见磨玻璃影[23]。根据病情严重程度选择不同的给氧方式，如鼻导管法、无创呼吸机辅助呼吸、气管插管。早期静脉应用肾上腺糖皮质激素对治疗无好处，如H1N1流行期间曾经用肾上腺糖皮质激素控制发热和炎症反应[24]，引起患者出现二重感染，甚至增加病死率[25]。有报道称，奥司他韦、帕拉米韦、扎那米韦抗病毒治疗有效[26]，但是其效果尚未被证实。

H7亚型禽流感病毒一直威胁着人类的健康和生命，给社会和个人造成沉重的经济负担，截止现在其传染源尚未确定，怀疑被感染的禽类是最主要的传染源。人类目前尚无办法预测其变异方向，缺乏特异性诊断和治疗的方法。病例追踪研究显示，感染H7N9后痊愈的患者血清中检测出终生免疫抗体[27]，同时基于H7N9病毒株研究获得的部分疫苗表现出同源交叉免疫，说明人类有可能得到一种对所有H7亚型病毒具有免疫原性的疫苗，这种疫苗将会是一种很好的预防手段，可减少人们痛苦，减轻社会负担。

[参 考 文 献]

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(本文编辑：熊辛睿)

[中图分类号]R373.1

[文献标识码]A

[文章编号]1671-9638(2015)12-0865-04