甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶3的研究现状

魏 敏 邢国兰

(郑州大学第一附属医院,郑州 450052)

补体系统是人体免疫系统的重要组成部分，通过酶级联激活而活化，其活化中间产物最终组装形成的攻膜复合物可发挥调理吞噬、化学趋化、介导细胞溶解、清除免疫复合物以及凋亡细胞等功能，在固有免疫和适应性免疫之间起着十分重要的连接作用。人体可通过三条不同前端通路途径激活补体：①经典途径(Classic pathway，CP)：补体C1分子亚单位C1q可通过结合抗原抗体复合物而相继活化C1r和C1s，C1s通过依次酶解C4、C2形成C3转化酶C4b2a；②旁路途径(Alternative pathway，AP)：正常情况下，血液中的C3存在持续而缓慢的低程度自发水解，当有病原体入侵，血液中自发裂解产生的C3b结合于病原体表面并与B因子结合形成C3bB，D因子可酶切B因子而生成C3转化酶C3bBb；③凝集素途径(Lectin pathway，LP)：血浆中存在的特定的模式识别分子(Pattern recognition molecule，PRM)可识别病原体表面的特殊抗原物质，通过级联活化甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶(MASPs)以及C4、C2形成C3转化酶C4b2a。 MASPs家族共包括五种蛋白成分：丝氨酸蛋白酶MASP1、MASP2、MASP3以及无酶活性的MAp44和MAp19。其中，MASP1和MASP2是参与凝集素途径活化的关键因子。MASP3于2001年首次发现[1]。此前人们普遍认为，MASP3通过与MASP1/2竞争结合凝集素途径的模式识别分子(PRMs)而负性调节补体凝集素途径的活化。近期有研究显示，MASP3参与D因子的活化[2,3]，而D因子为补体旁路途径活化的关键酶。通过活化D因子，MASP3可能参与补体旁路途径的活化。

补体是人体抵抗外来抗原侵害的重要成分，但其过度活化以及调节异常可导致各种免疫相关疾病。其中旁路途径不仅可以直接起始补体活化，并且可以在其他两条途径活化过程中起到反馈放大作用，其异常活化或调节异常参与多种疾病的发生发展，如C3肾小球病、非典型溶血尿毒综合征、IgA肾病、风湿性关节炎等。目前已有研究人员通过动物实验探索以MASP3为靶点在治疗旁路途径异常相关疾病中的作用，这也将为此类疾病提供新的治疗途径。

1 MASP3分子的基因位点、蛋白结构及组织学分布

MASP3、MASP1以及MAp44共同由MASP1/3基因编码[4]，是通过对mRNA 前体的选择性剪接而翻译得到的不同蛋白产物。人类MASP1/3基因位于3号染色体长臂的27～28位点[5]，长约50 kb，共包含18个外显子。外显子1～8以及10～11编码MASP1和MASP3共同拥有的N端五个结构域，12号外显子单独编码MASP3的连接区和蛋白酶结构域，而13～18号外显子共同编码MASP1的连接区和蛋白酶结构域。MAp44是由MASP1/3编码的另一个不具有酶活性的蛋白分子，其前4个结构域和MASP1/3相同，其后是单独由外显子9编码的17个氨基酸残基，无蛋白酶结构域。

MASP3蛋白全长共728个氨基酸残基(包括19个氨基酸残基构成的前导肽)，共有七个糖基化位点，其酶原形式的分子量大小为81 873 Da，而Western blot结果显示的蛋白条带大小约为94 kD[6]。MASP3和MASP1蛋白分子都是由一条肽链构成，其分子结构与MASP2以及C1r和C1s相类似。蛋白的N端由五个相连结构域(CUB1-EGF-CUB2-CCP1-CCP2)构成A链，其作用是钙依赖性地与凝集素途径模式识别分子结合形成复合物，蛋白的C端为丝氨酸蛋白酶结构域单独构成的B链，其上包含有酶活化位点。A链和B链之间为连接区。当MASPs蛋白活化时，A链和B链从酶活化位点处断开，但仍通过链间的二硫键相连。

在人体，MASP1/2主要表达于肝脏，在小肠内也有一定水平的表达，在其他器官内均无表达或低表达。MASP3蛋白表达的组织分布和MASP1/2并不完全一样。MASP3除了在肝脏高表达外，在结肠内也有较高水平的表达，并且在多种组织内都有一定水平的表达，如胰腺、心脏、肺以及肾和脾等[7]。MASP3在血浆中的平均浓度约为5.2 μg/ml[8]。

2 MASP3的活化和生物学功能研究进展

2.1MASP3在血浆中的存在形式以及活化机制 在钙离子存在的情况下，MASPs蛋白单体以CUB1-EGF-CUB2结构域形成同源二聚体并与凝集素途径的模式识别分子(PRM)结合形成复合物而存在于血循环中。目前发现的凝集素途径的模式识别分子包括有甘露糖结合凝集素(Mannose-binding lectin，MBL)、纤维蛋白胶凝素-1,2,3(Ficolin-1,2,3)以及胶原凝集素-10和11(Collectin-10,11)[9-11]。正常状态下，一个模式识别分子寡聚体只结合一种MASP蛋白[12]，但也有研究表明血浆中存在有高度寡聚体化的识别分子可以同时结合两种不同的MASPs蛋白的同源二聚体[13]。目前关于MASP1和MASP2以及补体凝集素途径的活化机制已了解较为清楚，PRM与病原微生物表面抗原结构结合使局部PRM/MASPs复合物的浓度增高，使得相邻复合物上的MASP1和MASP2酶原分子能够彼此靠近得以活化成为活性酶，从而引起凝集素途径的活化[14]。其中，MASP1首先自活化并起始MASP2的活化，MASP2最终通过裂解C4和C2形成与经典途径相同的C3转化酶C4b2a。MASP1也参与酶解C2，但无活化C4的活性[15-17]。关于MASP3的活化机制人们尚未完全研究清楚。MASP3无自活化活性[18]，体外研究表明，MAPS1可以活化MASP3[16]；此外，Iwaki等[19]研究显示，MASP1/3基因敲除小鼠以及MASP2基因敲除小鼠的血清活化MASP3蛋白的能力均较野生型小鼠减低，提示MASP1和MASP2可能参与体内MASP3的活化。C1 inhibitor是补体活化的负性调节蛋白，对C1r、C1s以及MASP1/2的活性均有抑制作用，但MASP3与C1 inhibitor无结合活性[18]，且目前尚未发现血浆中有其他的MASP3的特异性抑制物。MASP3在血浆中的活化以及其活性调节机制仍有待进一步研究。

2.2MASP3的生物学功能

2.2.1MASP3与D因子活化 MASP3和MASP1由相同基因编码，且同为补体凝集素途径的丝氨酸蛋白酶成分。然而与MASP1和MASP2不同的是，MASP3不参与C2、C4和C3的活化[18]。虽然既往研究表明MASP3可通过与MASP1/2竞争性结合模式识别受体而负性调节凝集素途径的活化[1,20]，但人们猜测这并非MASP3的主要功能。

直至2010年，Takahashi等[21]研究发现MASP1/3基因敲除小鼠(MASP1/3-/-，同时缺失MASP1和MASP3的表达)的血清无活化补体旁路途径的活性，且从该小鼠血清中分离得到的D因子经检测为无活性的前体形式，由此他们推测MASP1和MASP3可能和D因子的活化有关。而D因子为补体旁路途径活化的关键酶，通过酶切B因子而形成旁路途径的C3转化酶C3bBb，从而他们将补体凝集素途径和旁路途径的活化联系起来。随后，Iwaki等[19]在对MASP3活化和功能的研究中证实了MASP3在体外可活化D因子前体，他们甚至发现酶原形式的MASP3也同样有此活性，这进一步说明MASP3可能是D因子的活化酶。

然而，Ruseva等[22]再次对MASP1/3-/-小鼠进行检测时发现，小鼠血清旁路途径仍有低水平的活化，而非如Takahashi等[21]所描述的完全缺失。此外，在因MASP1/3基因突变导致的无正常MASP1和MASP3表达的3MC综合征(Malpuech，Michels and Mingarelli-Carnevale syndrome)患者血清中，Degn等[13]仍检测了一定水平的补体旁路途径活化的活性，由此他们推测该患者体内存在旁路途径活化所必需的成熟D因子，而MASP1或MASP3也并非旁路途径活化所必需的关键酶。然而令人意外的是，Takahashi等[23,24]在该病人血清中仅检测到了D因子前体。为什么MASP1/3-/-小鼠和MASP1/3基因突变的患者血清中只检测到D因子前体的情况下仍有一定水平的旁路途径活化活性？Degn等[25]给出了如下解释：一是循环中其他可活化D因子的酶可能起到了一定的代偿作用，使得在缺乏MASP1和MASP3的情况下仍有小部分D因子得以活化，但并未达到检测水平；另一种可能是前体D因子也有较低的B因子活化作用，使得在缺乏成熟D因子的情况下血清仍有较低的旁路途径活性。但是，关于MASP3在补体旁路途径活化过程中的作用人们仍无定论。

为了进一步研究清楚MASPs在D因子活化过程中所起的作用，Oroszlan等[3]对MASPs家族的三种蛋白酶进行了蛋白活性测定以及酶活性抑制实验。他们发现，成熟的重组MASP1、MASP2及MASP3在体外均有D因子活化活性，而相应酶原形式的MASPs均无此活性。与此同时，他们通过在血浆中加入重组D因子前体证明了正常人体血浆有活化D因子的活性。当在血浆中加入足量MASP1或MASP2特异性拮抗剂后，血浆的D因子活化功能未受影响，因此他们排除了MASP1和MASP2作为D因子活化酶的可能。而当加入足量的MASP3特异性抑制剂后，正常人体血浆活化D因子的活性消失，所加入的D因子仍以前体形式存在。由此他们得出结论：MASP3是正常生理状态下血液中唯一的D因子活化酶。而此实验中另一个有趣的发现是，当他们使用血清代替血浆标本，尽管加入了足量的MASP3抑制剂，血清中仍可以检测到低水平的D因子活化活性。对此他们给出解释：血液凝固过程中激活的凝血酶也有活化D因子的功能。这一发现也支持了人们此前的推论：3MC患者血清中检测到的旁路途可能是由其他可以活化D因子的酶导致，如活化的凝血酶。

综上所述，MASP3具有D因子活化活性，且为正常生理状态下血液中D因子活化的关键酶，其对于人体正常水平的旁路途径活性具有至关重要的作用。但关于MASP3活化D因子的具体机制以及D因子前体是否也具有一定水平的旁路途径活化活性目前尚未研究清楚。而在病理状态下，血液中异常活化的凝血酶、纤溶酶等其他具有D因子活化活性的酶可能也起到一定的D因子活化作用。

2.2.2MASP3与人体发育 MASP1/3基因突变可导致常染色体隐性遗传病——3MC综合征[26,27]。该病患者主要的临床表现包括有智力发育障碍，身材矮小以及典型的颅面部、脐腹部和骶尾部发育异常等。通过对6位3MC综合征患者进行基因检测，并结合之前研究结果，Atik等[28]指出，目前发现的MASP1/3基因的10个突变位点中，有7个突变是位于MASP3的特异性编码区域，对MASP1和MAp44无影响。另外三个位点位于三种蛋白的共同编码区。由此可见，MASP3除了具有补体活化活性，可能在人体发育过程中也起着重要的作用，而其具体的作用及机制仍有待探索。

3 MASP3在旁路途径异常相关疾病动物模型中的研究进展

补体旁路途径活化和调节异常是导致多种疾病发生和发展的重要原因。而D因子是旁路途径活化的关键酶，自Takahashi等[21]发现MASP3可能参与D因子活化以来，人们开始思考是否可以通过阻断D因子的活化进而抑制旁路途径的激活，从而减轻相关疾病中旁路途径活性异常所导致的靶组织器官损伤。

2010年，Banda等[29]通过注射药物诱发MASP1/3-/-小鼠出现胶原抗体诱导性关节炎(CAIA)，他们发现MASP1/3-/-小鼠的疾病活动性、关节局部C3沉积以及组织损伤程度均轻于野生型小鼠，他们也再次验证了在MASP1/3-/-小鼠体内D因子是无活性的酶原形式。由此他们认为MASP1或MASP3可以为旁路途径异常相关疾病提供新的治疗靶点。然而，研究人员从H因子基因敲除(CfH-/-)所致的C3肾小球病小鼠模型的研究中得到了相反的结论。H因子是补体旁路途径的负性调节因子，该系小鼠因缺乏H因子导致旁路途径活化调节异常而致病。 Ruseva等[22]通过CfH-/-小鼠和上述MASP1/3-/-小鼠杂交得到了CfH-/-MASP1/3-/-小鼠，他们在CfH-/-MASP1/3-/-小鼠血清中同样仅检测到了前体D因子的存在，但令他们意外的是，缺失MASP1和MASP3并未减轻CfH-/-小鼠的病情，CfH-/-MASP1/3-/-小鼠仍存在旁路途径的异常活化。因此他们推测，在因缺乏H因子而导致的补体旁路途径活化异常的病理状态下，旁路途径的活化并不依赖于MASP1或MASP3。

针对在CAIA和CfH-/-两种不同疾病模型中所得出的相悖结论，Degn等[25]认为这可能是两种疾病不同的发病机制所致，CAIA是由于旁路途径的异常激活所导致，而CfH-/-小鼠是旁路途径活性调节异常所导致。当调节功能正常时，MASP1和MASP3缺失所导致的旁路途径活性减低使得CAIA病情减轻。在CfH-/-小鼠模型中，MASP1和MASP3缺失虽只导致低水平的旁路途径活化，但在补体负性调节功能受损情况下，旁路途径仍可以通过反馈放大机制达到足够的活化水平从而导致疾病发生。而在最近，另一项应用小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)治疗CAIA小鼠模型的研究发现：当给患病小鼠全身或局部应用MASP1/3 siRNA时，小鼠的MASP1和MASP3的mRNA以及蛋白表达水平都有所减低，而小鼠的病情较对照组也明显减轻，由此他们认为，MASP1/3可以作为一个新的治疗靶点应用于风湿性关节炎的治疗[30]。

综上所述，关于MASP3活化D因子的功能的研究进展，现已证明MASP3有活化D因子活性，而在血浆中抑制MASP1活性并不能阻断D因子的活化，目前人们普遍接受的观点为MASP3是生理状态下D因子的主要活化酶。但由于以上所述的动物实验所应用的小鼠均为MASP1/3-/-小鼠，小鼠体内同时缺乏MASP1和MASP3的表达，故仅凭以上的动物疾病模型的构建无法排除MASP1在其中可能起到的作用(MASP1可能参与MASP3的活化)。综上，若想明确MASP3在补体旁路途径中的作用以及是否可以作为靶点应用于治疗，最好能够构建MASP3-/-小鼠以排除MASP1蛋白的干扰。

4 小结

MASP3是补体凝集素途径相关丝氨酸蛋白酶之一，其作为D因子活化酶这一新的生物学功能的发现将旁路途径和凝集素途径的活化紧密联系起来。已有动物实验证明阻断MASP1/3基因的表达可以有效减轻关节炎小鼠模型的临床症状，但对于H因子缺乏所导致的旁路途径调节异常却效果甚微。目前，关于MASP3的自身活化、酶活性调控以及其活化D因子的具体机制的研究仍十分有限。深入研究MASP3的功能活性以及其在补体旁路途径异常相关疾病中的作用将有助于我们深入了解此类疾病的发病机制以及探索新的治疗途径。

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