NLRP3炎症小体在肝疾病中的作用

孔德龙，崔 洁

(1.徐州医科大学病原生物学与免疫学教研室，江苏省免疫与代谢重点实验室，江苏 徐州 221004； 2.徐州医科大学生理学教研室，江苏 徐州 221004)

机体内免疫细胞通过表面和细胞质内的受体识别病原体或其产物而活化，活化的受体介导下游信号通路，启动炎症应答反应的发生。随着“危险信号假说”的逐渐发展，人们发现免疫细胞也可以在没有致病体存在的情况下，通过识别损伤细胞释放的内源性信号活化[1]。这两种情况相互补充，逐渐形成了炎症反应可由病原体入侵或来源于宿主的危险信号所诱发形成的观点，并且越来越多的证据表明其参与了许多疾病的致病机理过程，包括肝疾病。

1 NLRs模式识别受体

不同的病原体如肝炎病毒及肠道菌群的成分等都能够激活肝先天免疫反应，促进肝病变的发展[2]。这些微生物组分和病毒衍生分子通常称为病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)[3]；除微生物和病毒等外源性分子外，肝暴露于实质或非实质细胞受损伤时所释放的非病原体刺激物后也会诱发免疫反应，这些来自宿主的有害物质统称为损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMPs)，DAMPs代表内源性信号，在组织细胞损伤时释放并活化细胞的各种受体进而活化靶细胞，发挥各种生物学功能[4]。这些PAMPs或DAMPs通过与肝内表达于细胞膜或细胞质内的各种模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)相结合，诱导炎症反应的发生；PRRs作为机体抵抗各种危险因素的第一道防线，迄今为止已有四种不同家族被发现和证实，分别是跨膜蛋白类的Toll-样受体(toll like receptor, TLRs)、C 型凝集素受体(C-type lectin receptors, CLRs)以及属于胞浆内蛋白类的维甲酸可诱导基因I样受体(retinoic acid-inducible gene I-like receptor, RLR) 和NOD样受体 (nucleotide binding and oligomerization domain like receptors，NLRs)[5]。NOD 样受体是一类主要表达于胞浆内的重要PRRs，目前已发现的NOD样受体家族成员在人体内有22种，小鼠则有34种[6]。NLRs在感知不同的危险信号后能够诱发细胞质中称为“炎症小体”的蛋白复合物组装，其信号通路被激活后，NLR形成一个包含效应分子丝氨酸蛋白酶Caspase-1前体蛋白和ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)的复合物，活化的Caspase-1剪切加工并促进IL-1β等促炎细胞因子的成熟和分泌，进而构成组织局部炎症微环境的形成[7]。

2 NLRP3炎症小体的活化及功能

在众多能形成炎症小体的分子中，已发现在肝疾病中发挥功能作用的主要为NLRP3，AIM2和NLRP6，其中NLRP3在肝疾病中的研究最为广泛[8]。NLPR3炎症小体的活化主要包含两个过程：(1)病原体信号。如：脂多糖(LPS)能够通过NF-κB依赖的信号通路上调NLRP3表达[9]；(2)损伤相关信号。其中在肝疾病中典型的信号分别是ATP，尿酸，棕榈酸，胆固醇结晶和活性氧(ROS)[10-14]。目前，对于诱导NLRP3炎症小体活化的机制仍然是一个没有明确且存在众多争论的论题。不同的疾病或模型中其活化各不相同。较为普遍认可的理论主要有三个：(1)细胞外ATP通过P2X7受体导致细胞钾离子外流诱导NLRP3的活化[15]；(2)细胞吞噬胆固醇结晶，尿酸和淀粉酶等导致细胞内溶酶体破裂释放溶酶体组织蛋白酶B活化炎症小体[16]；(3)ROS依赖的方式活化[17]。然而目前并没有一个令人信服的理论能够更为全面详细的阐明NLRP3炎症小体活化的确切机制。

研究表明，炎症小体在肝疾病中的主要作用是其在肝不同细胞内活化后释放IL-1β进而诱发炎症反应[18]。此外，炎症小体活化诱导的趋化因子表达，进而招募各种免疫细胞到达受损的肝部位，在肝疾病的发生发展中也发挥重要作用[19]。有研究报道，IL-1β的促炎作用可能是由于其与TLR信号的协同效应显著扩大了LPS诱导的炎症因子释放[20]；而且，IL-1β信号可以进一步通过自分泌和旁分泌的方式而增强，例如：炎症小体介导的IL-1β释放促进其自身前体(pro-IL-1β)的转录水平升高、其他炎症小体组分的生成以及炎症因子和趋化因子的产生[21]，这样形成一种正反馈式的方式促进局部病变的不断加重。在肝疾病中，IL-1β能够促进肝脏中炎症细胞募集和肝星状细胞(HSCs)活化，参与肝纤维化发生[22]，也能促进甘油三酯在肝细胞中累积，进而联合肿瘤坏死因子(TNF)诱导肝细胞凋亡[23]。

除产生IL-1β影响肝局部微环境外，NLRP3炎症小体活化所引起的炎症因子IL-18和IL-33的释放也可能参与了肝疾病的发展。研究发现在使用缺乏蛋氨酸胆碱(MCD)饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)模型中，小鼠IL-1β信号的缺失并不影响NASH模型肝炎的加重，而IL-18的缺失改变了肠道菌群结构而更有利于诱导结肠炎菌群的产生，导致细菌代谢产物从肠道转移至肝，诱导炎症的发生，促进肝炎病情的恶化[24]。IL-33在肝疾病中的作用尚不完全清楚，有研究认为它是肝坏死细胞释放的一种警告信号[25]；在小鼠酒精性肝病、肝纤维化和缺血再灌注损伤模型中，IL-33的表达水平显著升高[26]。有报道发现，IL-33在华支睾吸虫感染所致的肝致病免疫调控中发挥重要作用[27]。然而，在刀豆蛋白-A诱导的急性肝损伤模型中，阻断IL-33信号并没有显著改善肝损伤作用[28]。IL-33在酒精、非酒精性肝病以及其他病因所诱发的肝损伤中的作用，仍有待进一步阐明。

炎症反应需要迅速高效地发挥作用后立即被机体有效地控制并及时消除已经出现的刺激因素，避免过度炎症应答。炎症小体活化所释放的IL-1β和IL-18等促炎细胞因子，其持续存在势必导致组织器官的损伤[29]，因此，诱发以及活化炎症小体的因素都需要被精细调控。基于此，对于抑制炎症小体的相关机制研究也逐渐受到广泛关注。自噬是由溶酶体介导的细胞自我保护过程，有研究发现，细胞内的自噬作用能够通过间接的抑制内源性刺激因素或者直接降解炎症小体组分从而抑制炎症小体活化[30-31]。另有研究报道，干扰素(IFN)通过调控转录因子STAT1的表达进而抑制NLRP1和NLRP3炎症小体活化[32]。在肝纤维化的药物治疗中也发现，抑制NLRP3炎症小体能够很好的改善纤维化的发生发展[33-35]。目前，有关抑制炎症小体活化的研究虽取得了一定成果，然而，具体调控NLRP3活化的精确靶点仍不是十分清楚，需要更多的临床及动物模型研究进行深入探讨。

3 NLRP3炎症小体在不同肝疾病中的作用机制

3.1 酒精性肝病

急性饮酒会诱导脂肪肝的发生，长期酗酒导致脂肪性肝炎、肝纤维化甚至肝硬化。晚期酒精性肝病伴随的肝硬化或严重酒精性肝炎通常是不可逆转的，最终引起肝功能衰竭。在急性酒精性肝病的患者中发现，病人肝中的Caspase-1、NLRP3表达水平明显升高[36]，并且，严重酒精性肝病患者与正常人相比，血清中IL-1β水平显著升高[37]。有研究发现，NLRP3炎症小体参与酒精诱导的肝细胞死亡[38]。而一些能够活化NLRP3炎症小体的小分子物质如尿酸、ATP等介导了肝内肝细胞和免疫细胞之间的相互作用，加快了病程的恶化[39]。这些研究都表明，NLRP3炎症小体的活化促进了酒精性肝病的发展。

然而，在酒精性肝病中，能够激活NLRP3炎症小体活化的信号尚没有完全阐明。有研究发现，肠道来源的LPS通过TLR4信号通路是诱导IL-1β释放的第一信号[40]。另有研究报道，酒精诱导的线粒体功能障碍导致尿酸和ATP等小分子代谢紊乱是参与NLRP3炎症小体活化的第二信号[41]。在小鼠诱导酒精性肝病的模型中发现，酒精处理组的小鼠血清中尿酸水平显著升高，在使用尿酸合成抑制剂后肝炎症和肝损伤程度都得到显著改善[42]。尽管无菌性炎症信号在酒精诱导肝脏炎症中的作用还不十分清楚，但现有的研究提示，来自肠道的PAMPs和来源于肝细胞的DAMPs在酒精性肝病发病过程中的发挥着重要作用。或许以NLRP3炎症小体和IL-1β为作用靶点将为酒精性肝病的治疗提供新的治疗手段。

3.2 非酒精性肝病

NLRP3炎症小体活化在非酒精性肝病中的作用已经引起众多研究者的关注。在代谢综合征和胰岛素抗药性研究中表明，炎症小体的活化参与了疾病的发展[43-44]，而这些疾病过程都能够诱发非酒精性肝病。研究发现，在2型糖尿病患者血液单核细胞内NLRP3炎症小体信号通路显著活化[45]。另有报道，在非酒精性肝病动物模型研究的早期阶段，肝被认为发生脂肪变性但是缺少炎症反应，炎症小体信号通路相关分子NLRP3、ASC和Caspase-1的mRNA水平升高，但是却没有NLRP3炎症小体的活化发生(Caspase-1的剪切活化)[46]。提示我们，组织或细胞特异性炎症小体的启动可能促进了疾病的进展，并最终扩展到其他器官内。基于复杂的肝细胞环境，研究细胞特异性炎症小体活化在非酒精性肝病发展中的作用显得尤为重要。因为在酒精性肝病的研究表明肝中巨噬细胞NLRP3炎症小体的活化起重要作用[47]，但NLRP3炎症小体在非酒精性肝病中的作用比预想的更加复杂。在非酒精性肝炎中，除了肝免疫细胞外，肝实质细胞也介导了NLRP3炎症小体的活化。在MCD饮食诱导的非酒精性肝炎小鼠模型上表明，无论骨髓来源的单核巨噬细胞还是肝实质细胞均参与了NLRP3炎症小体的活化[21]。而在非酒精性肝炎中，NLRP3炎症小体在肝特异性作用是由不饱和脂肪酸诱导的，它能够上调并且活化肝细胞中NLRP3炎症小体，诱导IL-1β产生[48]。为了阐明肝细胞中NLRP3炎症小体活化的作用，有研究者利用过表达NLRP3的小鼠模型，尽管该实验没有特异性的研究非酒精性肝炎的肝病理过程，但是小鼠全身NLRP3炎症小体活化介导了肝细胞发生细胞焦亡(一种炎症小体介导的细胞死亡形式)[49]。而NLRP3炎症小体在骨髓来源的细胞中活化并没有明显导致肝病理损伤[50]。另有研究报道，胆碱缺失饮食能够诱导肝细胞死亡以及炎症小体活化和肝纤维化发生，而敲除NLRP3后这些症状得到显著减轻[51]，提示NLRP3炎症小体活化在非酒精性肝炎中是必不可少的。

3.3 HCV感染所致肝病

全球范围内约有1.8亿人感染HCV[52]。HCV病毒能够识别TLR2、3、4、7、8、9等多种细胞内模式识别受体并且能够诱导IFN的生成[53-54]。有研究发现，HCV感染引起巨噬细胞IL-1β的释放促进肝病变[55]。而利用小干扰RNA(siRNA)阻断TLR3、TLR7、TLR8和TLR9后，HCV诱导的炎症小体活化被显著抑制[56]。在感染HCV患者单核细胞中炎症小体活化能够导致IL-18产生，进一步活化自然杀伤T细胞；HCV病毒能够通过诱导细胞内NLRP3炎症小体活化，促进胆固醇调节元件结合蛋白(SREBP)表达，进而诱发脂质代谢紊乱，介导肝脏病变[57]。综合以上数据表明，HCV感染能够诱发炎症小体活化并参与其引起的肝病变过程，虽然HCV感染所诱发肝病变中涉及NLRP3炎症小体活化的相关研究，目前仍处于早期阶段，但我们相信，聚焦特定靶细胞及肝内不同细胞间的相互作用，深入探索HCV感染致病过程中NLRP3炎症小体活化在机体免疫调控中的作用，无疑将为HCV感染致病机制的研究及病毒性肝炎的临床治疗，提供新的思路。

3.4 肝纤维化

炎症小体可以通过直接或间接作用调节肝纤维化过程。其直接调节主要通过肝星状细胞(HSCs)内炎症小体的表达进而促进肝纤维化发生[58]。研究发现，经典的诱导炎症小体活化物质如尿酸结晶，可以活化小鼠原代HSCs和人肝星状细胞系LX-2，尿酸结晶可以上调转化生长因子(TGF-β)表达诱导HSCs活化并且诱导胶原等细胞外基质的产生和积累，而当敲低HSCs内ASC基因后，细胞外基质的过量产生得到显著改善[59]。炎症小体间接调节肝纤维化过程是通过诱导肝巨噬细胞分泌IL-1β和IL-18进而促进HSCs活化发挥作用。肠道来源的PAMPs和肝细胞损伤释放的DAMPs都能够活化肝巨噬细胞炎症小体，诱导HSCs活化促进肝纤维化发生[60]。在肝纤维化小鼠模型中，IL-1β水平显著升高，并且减少IL-1受体的表达能够显著抑制纤维化发生[61]。此外，在大鼠模型中，阻断IL-1β信号能够抑制四氯化碳诱导和硫代乙酰胺诱导的肝纤维化发生，敲低NLRP3或ASC的表达能够显著减少TGF-β和1型胶原蛋白的表达[62]。另有研究表明，Caspase-1作为关键的调控因子，在高脂诱导的肝纤维化中同样发挥重要作用[63]。而且研究发现，NLRP3通过IL-1R/MyD88参与了肝纤维化关键分子MMP与TIMP平衡的调控，促进了细胞外基质的沉积[64]。这些报道都表明，NLRP3炎症小体参与了肝纤维化的发生发展。

纤维化形成的一般机制可能适用于大多数慢性肝病，但是，目前有关炎症小体在除了酒精性肝病和非酒精性肝病外，其他肝纤维化疾病中作用的研究报道还是比较少。NLRP3炎症小体在肝纤维化中的作用机制还有待于进一步阐明，其是通过DAMPs对HSCs的直接活化作用还是通过DAMPs间接诱导肝内免疫细胞分泌IL-1β和IL-18进而激活HSCs促进纤维化发生，仍需更多的相关理论及疾病模型进行深入探讨和研究。

4 总结

综上所述，肝病变中，来自损伤肝细胞的无菌炎症信号和来自肠道细菌或病毒感染细胞的病原体相关分子模式参与了肝致病过程。这些信号分子通过不同的信号转导途径诱导NLRP3炎症小体蛋白复合物的组装和活化，最终导致生物活性分子IL-1β、IL-18和IL-33的产生以及诱发细胞焦亡，而炎症小体活化促使IL-1β等促炎因子在肝沉积，诱导肝细胞死亡以及更为关键的诱导炎症小体瀑布式级联反应在肝损伤过程中发挥重要的生物学效应。然而，在不同病因所诱发肝病理损伤中，NLRP3炎症小体的具体激活途径、调控NLRP3活化的不同靶点及其相互联系以及肝微环境对炎症小体活化的影响等仍需更多疾病模型进行探讨。我们希望通过对NLRP3炎症小体在酒精性肝病、非酒精性肝病、慢性HCV感染和肝纤维化中的作用及主要的最新研究成果的整合及分析，进而能更加深入的了解NLRP3炎症小体功能及在肝致病中的重要性，这既有助于为将来确切阐明其在肝疾病发病中的作用机制，也有利于寻找有效的调控NLRP3炎症小体活化的相关信号分子或药物，从而为临床肝疾病的治疗提供更加直接有效的药物作用靶点。