延长溶栓时间窗在缺血性脑卒中tPA治疗的临床前研究进展

陶依然，刘婷婷，孙芳玲，艾厚喜，郭德玉，王 文

(首都医科大学宣武医院实验动物室，北京 100053)

美国国立卫生研究院(national institutes of health，NIH)最初认为组织型纤溶酶原激活剂(tissue type plasminogen activator, tPA)治疗急性脑梗死的溶栓治疗时间窗应在3 h内。2008年欧洲急性卒中协作研究Ⅲ(the european cooperative acute stroke study，ECASS-3)试验研究结果显示，tPA的有效治疗时间窗可延长至4.5 h[1]。如果超过tPA的治疗时间窗进行溶栓治疗则会产生一系列的副作用，比如神经毒性、水肿、出血性转化等[2]。目前，出血反应是溶栓药普遍存在的不良反应之一，严重的出血性转化(hemorrhagic transformation，HT)可以导致脑卒中患者死亡率显著增加[3]。HT是指由于脑梗死后缺血区重新恢复血流供应引起的继发性出血[4]。HT的机制很复杂，目前尚不明确，主要认为与血脑屏障受损、细胞质基质降解、血管新生、高血压、炎症反应等有关。tPA治疗引起的HT与血脑屏障(blood brain barrier，BBB)通透性增加及相关的微血管的破损有关[5]。血脑屏障的破坏是HT发生的基础，血脑屏障包括毛细血管的基底膜和内皮细胞间的紧密连接。失去血流供应时，血脑屏障完整性受损。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)是细胞内基质的主要降解酶，与血管壁细胞外基质的破坏和重建有密切的关系。脑缺血患者基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)和基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)表达量显著增加，溶栓后MMP及其抑制剂比例严重失调，使得细胞质基质中层粘连蛋白laminin和组成BBB的紧密连接蛋白(ZO-1, occludin)等被降解，从而导致出血。缺血早期微血管内皮细胞上出现白细胞粘附受体，微血管完整性改变，微血管生成被激活，提示血管新生参与了HT的过程[6]。同时高血压，炎症因子等也与HT有关。寻找具有治疗时间窗长、副作用小的脑卒中有效治疗药物对于脑卒中患者具有非常重要的意义。

由于扩大tPA治疗时间窗引起的HT与血脑屏障通透性增加及相关的微血管破损有关，所以可以通过药物靶向性阻止血脑屏障破坏和促进血管新生来减轻HT。本文主要结合HT的相关机制，探讨在临床前研究中可减轻超过tPA治疗时间窗(中风发作后4.5 h)而带来不良反应的药物。其中包括保护血脑屏障的药物(例如，米诺环素，西洛他唑，法舒地尔，坎地沙坦和内酯)和促血管新生的药物(如香豆素衍生物IMM-H004和粒细胞集落刺激因子)等。

1 血脑屏障保护剂

1.1 米诺环素

米诺环素是一种四环素衍生物，临床用于治疗痤疮。研究表明米诺环素是一个很好的MMP抑制剂[7]，具有神经保护作用。米诺环素(3 mg/kg，静脉注射，卒中后4 h)和tPA(10 mg/kg，静脉注射，卒中后6 h)联合使用能减少梗死体积，并在中风后24 h后改善脑出血情况[8]。米诺环素与tPA联合使用不仅可以扩大时间窗还能降低神经功能评分，降低死亡率[9]。米诺环素的神经保护机制尚不明确，可能与其抗炎、抗氧化和抗凋亡作用有关[10]。米诺环素通过抑制缺氧诱导因子HIF-1α介导的细胞反应，保护血脑屏障[11]，减少小胶质细胞活化，抑制基质金属蛋白酶的表达，减少神经元的凋亡[12]。

1.2 西洛他唑

西洛他唑是FDA批准治疗间歇性跛行的药物[13]。在小鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型中[14]，再灌注后6 h给予tPA(10 mg/kg，静脉注射)和西洛他唑(10 mg/kg，静脉注射)联合治疗能减轻HT，将时间窗扩大到18 h，连续7 d给药能减轻脑水肿，降低发病率和死亡率，提高神经功能。此外，西洛他唑能降低tPA治疗延迟引起的MMP-9活性上调，抑制微血管内皮细胞之间的紧密连接蛋白claudin-5的减少[15]，保护血脑屏障不被破坏来减少HT的风险。在体外试验中，西洛他唑可以通过影响cAMP去阻止tPA引起的内皮细胞和周细胞损伤。

1.3 GM6001

GM6001是一种广谱的MMP蛋白抑制剂，能够与MMPs的活性位点结合阻止金属基质酶前体向金属基质酶转化[16]。在大鼠MCAO造模后6 h给予GM6001(100 mg/kg，腹腔注射)和tPA(10 mg/kg，静脉注射)联合治疗，可降低tPA引起的脑血红蛋白含量升高，并降低HT[17]。免疫印迹结果显示再灌注后42 h联合治疗能减少MMP-9含量，并且降解封闭蛋白occludin和紧密连接蛋白ZO-1，但是对紧密连接蛋白claudin-5表达无影响[17]。单独用GM6001治疗也能明显提高缺血再灌注大鼠的存活率并改善大鼠神经功能。体外实验结果显示，GM6001能阻止tPA引起的内皮细胞减少和跨内皮电阻损坏。该药物的其他潜在机制有待深入研究，如对肿瘤坏死因子TNF-α和肿瘤坏死因子转换酶表达的影响等[17-18]。

1.4 法舒地尔

法舒地尔是一个Rho激酶抑制剂，即细胞内钙离子拮抗剂，在日本作为蛛网膜下腔出血后发生脑血管痉挛的治疗药物销售[19]。与MCAO造模后6 h单独使用tPA(10 mg/kg，静脉注射)对大鼠进行治疗相比，tPA联合法舒地尔(3 mg/kg，腹腔注射)治疗可以改善再灌注18 h后的HT。降低再灌注7 d后的大鼠的死亡率，改善神经功能。体外研究结果表明，法舒地尔与tPA联合治疗可以通过降低MMP-9活性减轻人脑微血管内皮细胞损伤[20]。此外，乳酸脱氢酶相关实验还表明，法舒地尔不仅能对抗tPA诱导的急性和亚急性脑损伤也能保护受损内皮细胞[20]。法舒地尔长期神经血管保护作用和改善tPA诱导的HT确切分子机制和与tPA联合应用时的最佳剂量还有待进一步研究[20]。

1.5 坎地沙坦

坎地沙坦是一种血管紧张素ⅡAT1受体拮抗剂，可以减少由缺血性脑卒中引起的损伤[21-22]。在脑缺血动物模型中，在卒中后3 h给予坎地沙坦(1 mg/kg)和卒中后6 h给予tPA(10 mg/kg，静脉注射)联合治疗，能减少脑出血并改善神经功能[23]。研究显示，与对照组相比，联合治疗可以减轻tPA治疗脑缺血大鼠后的引起的颅内出血，并且降低金属基质蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3，MMP-3)含量，但对MMP-9无影响。此外，坎地沙坦和tPA联合治疗能降低核因子κB(nuclear factor kappaB，NF-κB)与肿瘤坏死因子 TNF-α的表达水平。坎地沙坦的治疗还能增强内皮型一氧化氮合酶的活性，其对血管功能的调节至关重要的，最终起到卒中后的神经保护作用[24]。

1.6 苔藓虫素

苔藓虫素是自海洋生物草苔虫中提取的一种PKC活化剂，在中老年雌性大鼠MCAO造模后6 h给予治疗能显著降低缺血性脑损伤[25]。通过注入自体血栓制作雌性大鼠MCAO模型，造模后2 h给予苔藓抑素(2.5 mg/kg，静脉注射)能减少延迟tPA(5 mg/kg，静脉注射)治疗引起的脑肿胀、脑出血和24 h内的死亡率[26]。苔藓虫素也能减轻血脑屏障的破坏和出血性转化，并下调MMP-9的表达，上调PKCɛ表达[26]。MMP-9调控蛋白激酶C的机制[27]可能在苔藓虫素减少延迟tPA引起的HT和血脑屏障破坏起到了有益的作用。

2 促血管新生药物

因为血管破裂是脑出血的主要原因，血脑屏障的破坏是次要原因[28]。所以除保护血脑屏障的完整性外，促进新生血管也可能减弱延迟tPA引起的HT。新生的血管可为神经的新生提供神经营养因子，并为新生的神经细胞迁移到缺血周边区域提供依附的支架，是梗死周边区域脑组织抗损伤和神经元修复的结构基础[28]。此外，研究表明血管新生发生在缺血区，有助于改善梗死、脑血流和神经元功能的恢复[29]。

2.1 香豆素衍生物IMM-H004

香豆素类化合物是一类重要的具有多种生物活性的有机杂环化合物, 具有调节植物生长、抗菌抗病毒、抗凝血、松弛平滑肌、吸收紫外线和抗辐射等多种生物活性[30]。在卒中后6 h tPA(10 mg/kg，静脉注射)与IMM-H004(6 mg/kg，静脉注射)联合治疗能减少出血、大鼠脑梗死体积和脑水肿[31]。同样有研究表明，在用线栓法制备的大鼠脑缺血模型中，联合治疗能减少tPA引起的HT和梗死体积[32]。脑缺血7 d后，IMM-H004能促进血管生成，改善血管内皮细胞的完整性，改善脑血流。体外实验表明，IMM-H004可以增加ATP和PKA的水平，并且在HBMECs和PC12细胞中激活Akt和PI3K，通过调节cAMP/PKA和PI3K/Akt信号通路促进血管新生[31]。作者认为，IMM-H004能减少tPA治疗引起的出血性转化与促进血管新生有关[31]。

2.2 粒细胞集落刺激因子

粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)是能在体内外调节造血干细胞存活、增殖、分化以及成熟白细胞功能的一组糖蛋白生长因子[32]。有研究表明，在诱导大鼠脑卒中后，将时间窗扩大到6 h给予G-CSF(300 μg/kg，静脉注射)与tPA(10 mg/kg，静脉注射)联合治疗7 d与单独使用tPA相比，能改善大鼠神经功能和运动能力。此外使用G-SCF治疗也降低了死亡率，减少延迟使用tPA引起的HT和血红蛋白减少[33]。此外，能明显增加缺血侧大脑Ang-2、vWF、磷酸化eNOS、CD34+内皮细胞和VEGFR-2的含量，并且改善大鼠24 h后神经系统功能。因此，G-CSF通过促进内皮干细胞血管新生和修复的机制来降低延迟tPA引起的HT从而提高卒中后的神经功能[33]。值得注意的是，在临床研究中发现生长因子如VEGF、Ang-1和G-CSF能增强动脉再通和提高tPA治疗急性缺血性脑卒中患者的临床预后[34]。以上这些研究结果表明，G-CSF可以减少延迟tPA治疗引起的HT。目前，关于G-CSF疗效评价仅局限于急性脑卒中，其对脑血管保护的长期疗效还不清楚。G-CSF在脑卒中模型中的最佳剂量还在研究中[35]，并评价其联合治疗的效果，以期进一步提高该方法的临床应用前景。

3 其他

目前，关于自由基与抗氧化剂[36]在延迟tPA治疗时间窗中的作用也进行了研究。此外，促红细胞生成素在急性脑缺血中也被证实能改善神经功能。维生素C与十二氟戊烷乳剂(dodecafluoropentane emulsion，DDFPe)等也有较多研究，但这些研究仅证明了这些药物干预措施能改善中风，关于其对HT的影响目前尚未确定。

3.1 维生素C

局灶性缺血脑损伤后谷胱甘肽和抗坏血酸水平降低，自由基形成增加，从而加重血脑屏障的破坏，补充维生素C可以来改善缺血性脑损伤后的预后[36]。研究证明，维生素C具有中和自由基，特别是在脑实质中保护内皮细胞功能和抗氧化的作用，能对抗延迟tPA引起的不良反应[37]。脑卒中后5 h，低剂量tPA(1 mg/kg)和维生素C(500 mg/kg)联合治疗组大鼠与单独给予tPA组大鼠相比，卒中后48 h脑梗死体积和水肿明显减少。同时，联合治疗也能减少延迟tPA引起的MMP-9水平增加和血脑屏障的损坏[37]。维生素C可能是通过中和自由基，来保护血脑屏障，从而减轻延迟tPA带来的不良反应和发挥神经保护作用的功效，表明其具有扩大tPA治疗窗的辅助治疗药物的潜力。

3.2 DDFPe

DDFPe纳米质粒是一种氧运输蛋白，在脑缺血模型中可发挥脑保护作用。在新西兰兔脑卒中栓塞模型中检测DDFPe(0.3 mL/kg)能否延长tPA治疗时间窗(0.9 mg/kg，卒中后9 h给予)[38]，结果显示联合治疗能将tPA治疗时间窗有效延长至9 h，并没有增加出血转化的风险。并且能改善在24 h后的神经功能评分和脑梗死体积。但是其研究者只研究了9 h这个时间点，关于其他时间点的疗效和其他动物模型还有待进一步研究[38]。其作用机制可能是在在血细胞不足的时候改善了氧气的运输，具体机制还有待研究。

3.3 促红细胞生成素

促红细胞生成素(erythropoietin, EPO)是由肾脏和肝脏分泌的一种激素样物质，能够促进红细胞生成，对心脏、神经等组织器官具有抗凋亡，促进血管再生等作用[39]。有研究表明重组人类促红细胞生成素对急性脑缺血有很好的治疗效果[40]。局部血管内注射tPA联合低剂量截短寡糖链的Neuro-EPO可以减少大鼠脑缺血再灌注24 h的病死率，改善神经功能，同时减少脑水肿和脑出血。而且Neuro-EPO没有EPO的红细胞生成功能，从而避免了血细胞比容增加导致的血液动力学改变[41]。目前认为大脑中动脉低剂量注射促红细胞生成素可能是通过激活AKT和ERK通路发挥神经保护作用，具体机制还有待进一步研究。

4 总结与展望

本文探讨了可以延长tPA溶栓治疗时间窗的药物，以及能够降低晚期溶栓治疗引起的出血转化风险的药物。延长时间窗进行溶栓治疗不仅可以通过药物和干细胞来实现，也可以通过其他非药物途径。通过脑成像技术可以确定出血转化风险高的患者和临床预后不良的患者，预测溶栓后的出血风险以改善tPA的治疗时间窗和治疗方法，提高安全性[42]。以前的试验还表明，血管内手术，例如动脉取栓，能改善卒中患者静脉溶栓。近期，最新的一项研究表明，灌注成像可筛选出颈内动脉颅内段或大脑中动脉近段闭塞引起的急性缺血性卒中患者。这部分患者在超出tPA溶栓时间窗(发病6～24 h)的情况下仍可通过血管内血栓切除术清除血栓改善临床结局[43]。取栓加溶栓治疗相比溶栓已被证明可以改善功能预后，降低患者的死亡率[44-45]。今后有可能在成像技术的指导下把握好治疗时间窗，根据不同的个体情况，联合应用溶栓和神经保护疗法，以便能安全、有效的改善缺血性脑卒中患者的功能恢复。