超临界CO2法萃取树莓籽油的成分分析

刘雅萍，李鸿雁，郑 莉，常 明，李 斌，金青哲，王兴国(.江南大学 食品学院，江苏 无锡 4； .沈阳农业大学 食品学院，沈阳 0866)

树莓(RubuscorchorifoliusL.f.)，又名马林、木莓、托盘，是蔷薇科(Rosaceae)悬钩子属(Rubus)植物，为多年生落叶性灌木型果树，适应性极强[1]。树莓在国际市场上被誉为“黄金水果”，不仅其果肉口感良好，柔嫩多汁，香味独特，而且含有大量的功能因子[2]，尤其树莓籽油中含有大量的不饱和脂肪酸及人体必需的脂肪酸，其中亚油酸、亚麻酸、油酸等不饱和脂肪酸含量较高[3]。现国内外虽对悬钩子属植物研究较多，但总体来讲对树莓的报道较少，且报道之间存在较大差异，绝大部分都集中在栽培、加工和推广上，并没有做系统的研究[4-8]。了解脂肪酸的组成对树莓籽油的进一步开发利用具有重要意义，而脂肪伴随物，如植物甾醇、生育酚、多酚等，因其特有的对人体有很多有益的功能，被广泛应用于医药、食品、化妆品等行业[9]。本试验采用超临界CO2法萃取树莓籽油，并对树莓籽油的脂肪酸及脂肪伴随物成分进行分析与探讨，旨在为树莓产业链的延伸提供理论参考和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

树莓(市场购入)，正己烷、甲醇、乙酸乙酯、95%乙醇、氢氧化钾、无水乙醚、无水乙醇、抗坏血酸、无水硫酸钠、无水碳酸钠，均为分析纯；福林酚试剂；没食子酸标准品，纯度≥98%；生育酚标准品；甾醇内标(5α-胆甾烷醇)；BSTFA+TMCS(99∶1)硅烷化试剂，购于美国Sigma公司；19-羟基胆固醇(纯度>98%)，购于美国Steraloids公司。

1.1.2 仪器与设备

超临界CO2萃取设备，美国Waters公司；Trace GC Ultra气相色谱仪；ISQ质谱检测仪；AR2140型电子分析天平；Al3000型自动进样器，美国Thermo公司；DHG-9076A型电热恒温鼓风干燥箱；Anke TGL-16G型台式离心机；ZK-82BB型电热真空干燥箱；HH-2型数显恒温水浴锅；安捷伦1260高效液相色谱仪；Diol-SPE固相萃取柱(填料为二乙醇基)；SHZ-Ⅲ型循环水式多用真空泵；723型紫外可见分光光度计。

1.2 试验方法

1.2.1 树莓籽油的制取

树莓去皮去果肉后得到树莓籽，清洗烘干，粉碎过60目筛后，取树莓籽粉115.00 g，装柱密封，安装并调试超临界萃取设备，设置参数，萃取温度40℃，压力300 MPa，CO2流速40 g/min，萃取时间100 min。萃取结束，收集产物树莓籽油。经两次平行试验分别得到树莓籽油20.097 4、20.977 8 g，出油率为17.90%±0.3%。

1.2.2 树莓籽油脂肪酸组成测定

1.2.2.1 样品前处理

参照文献[10]进行甲酯化处理。

1.2.2.2 GC条件

PEG-20000毛细管柱(100 m×0.25 mm×0.25 μm)；升温程序为初始温度80℃保持3 min，以10℃/min升至220℃，保持20 min；进样口温度250℃；进样量1.0 μL；分流比50∶1；载气为氮气(99.999%)；燃烧气为氢气(99.999%)和空气；检测器温度250℃；氢气压力60 kPa；空气压力50 kPa；柱前压220 kPa。

根据标准品确定脂肪酸的种类，并利用峰面积归一化法计算相应脂肪酸含量。

1.2.3 树莓籽油甾醇测定

1.2.3.1 样品前处理

准确称取树莓籽油0.200 g置于50 mL离心管，加入0.5 mL质量浓度0.1 mg/mL的5α-胆甾烷醇作为内标，随后加入3 mL 2 mol/L KOH-乙醇溶液，85℃水浴加热1 h，取出冷却至室温后加入2 mL 水和5 mL正己烷，离心提取上层清液，并对下层用5 mL正己烷重复提取两次，合并有机液，加入2 mL水，振荡后提取上清液于15 mL离心管，利用氮气吹干，加入BSTFA+TMCS(99∶1)硅烷化试剂200 μL，放置于75℃水浴30 min。取出冷却后，过0.22 μm有机膜，待GC-MS分析。

1.2.3.2 GC-MS条件

DB-5色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升温程序为初始温度200℃保持0.5 min，以10℃/min升至300℃，保持18 min；进样口温度280℃；进样量1.0 μL；分流比100∶1；载气为氦气(99.99%)，流速1.2 mL/min；离子源温度250℃；传输线温度280℃；EI离子化模式；分子离子碎片扫描范围(m/z)50～550。

1.2.4 树莓籽油生育酚测定

1.2.4.1 样品前处理

准确称取1.500 g树莓籽油于皂化瓶中，加入30 mL无水乙醇，振荡后加入5 mL质量分数10%的抗坏血酸和10 mL质量分数50%的KOH溶液，混匀后立即置于沸水浴回流50 min，取出后放入冰水中冷却。转移至分液漏斗，分别用50 mL水、100 mL乙醚各洗涤2～3次皂化瓶，轻微振摇后静置1 min，弃去下层，继续加水洗涤，至下层流出的水不呈碱性停止萃取。将上层溶液用无水Na2SO4过滤并转入蒸发瓶，加入少量乙醚洗涤无水Na2SO4及分液漏斗2～3次，利用旋转蒸发仪于40℃水浴中减压蒸馏 5 min，再用氮气吹掉乙醚，立即加入2.00 mL乙醇溶解，将溶解物转移到5 mL离心管，于10 000 r/min，离心5 min，取上清液过0.22 μm膜，待HPLC分析。

1.2.4.2 HPLC条件

Sehperisorb Silica色谱柱(25 cm×4.6 mm×5 μm)；柱温30℃；检测波长295 nm；流动相为正己烷-异丙醇(体积比98.5∶1.5)；流速1 mL/min。

1.2.5 树莓籽油多酚测定

分别用6 mL甲醇和6 mL正己烷过SPE柱使其活化。称取树莓籽油1.500 g，将样品溶于6 mL正己烷中过柱，再分两次用3 mL正己烷洗SPE柱，加入4 mL正己烷-乙酸乙酯(体积比9∶1)过柱，后加入甲醇洗脱并收集洗脱液，将洗脱液转移至10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，后移取5 mL置于另1个10 mL容量瓶中，加入0.5 mL福林酚反应3 min，再加入1 mL 10%的Na2CO3溶液，用水定容，暗反应2 h，过0.45 μm膜。用紫外可见分光光度计于765 nm波长下检测其吸光度，并根据标准曲线(y=0.062 3x+0.042 7)计算多酚含量。

2 结果与讨论

2.1 树莓籽油脂肪酸组成

经过GC检测分析，确定了树莓籽油的脂肪酸组成及相对含量，结果见表1。

表1 树莓籽油中脂肪酸组成及相对含量

从表1可以看出，树莓籽油中共检测到10种脂肪酸，其中有7种不饱和脂肪酸，含量高达96.99%，以亚油酸含量(57.44%)最高，其次是α-亚麻酸(26.58%)、油酸(11.94%)。亚油酸是最早被确认的必需脂肪酸，是一种在人体发挥重要作用的多不饱和脂肪酸，不但具有降血脂作用，而且具有很高的抗癌活性、增强胰岛素、增强免疫力、减肥等功效[11]。α-亚麻酸能够转化为人体必需的DHA、EPA[12]，是一种优良的不饱和脂肪酸。

2.2 树莓籽油甾醇组成

经过标准谱库检索及文献对照，确定出树莓籽油中甾醇类化合物组成，结果见表2。

从表2可以看出，树莓籽油中除含有β-谷甾醇、环阿屯醇、豆甾醇、羊毛甾醇和菜油甾醇外，还含有其他多种甾醇化合物。β-谷甾醇和豆甾醇是比较常见的植物甾醇，主要存在于植物的根、茎、叶、果实和种子中，具有降血脂、抗癌、抗炎症等功效[13]。本试验测得菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、羊毛甾醇、环阿屯醇、24-亚甲基环阿屯醇、其他甾醇分别占总甾醇含量的3.38%、1.28%、76.95%、2.72%、2.80%、6.26%、6.61%。树莓籽油中总甾醇含量达861.85 mg/100 g，高于大豆油、大蒜油、花生油、茶油、芝麻油、玉米油、葵花籽油、橄榄油、葡萄籽油、姜油、花椒油、辣椒油、芥末油中的含量[14-15]。

表2 树莓籽油中甾醇类化合物组成

2.3 树莓籽油生育酚组成(见表3)

表3 树莓籽油中生育酚组成及含量 mg/kg

从表3可以看出，在生育酚的3种异构体中，γ-生育酚的含量最高，达到799.248 mg/kg，其次是α-生育酚和δ-生育酚含量，分别为602.996 mg/kg和13.371 mg/kg。总生育酚含量尤其是γ-生育酚含量均高于橄榄油、葵花籽油、核桃油、菜籽油、亚麻籽油、葡萄籽油、芥花籽油、花生油、玉米油、米糠油、芝麻油和大豆油中的含量[16-18]。

2.4 树莓籽油多酚含量

根据测定的吸光度及标准曲线计算。得出树莓籽油中多酚平均含量为(341.19±8.94)mgGAE/kg，高于初榨橄榄油中的含量[19]。

3 结 论

对超临界CO2技术萃取制得到的树莓籽油的脂肪酸和脂肪伴随物进行了分析，结果表明：树莓籽油中不饱和脂肪酸含量高达95%以上，主要是亚油酸(57.44%)、α-亚麻酸(26.58%)和油酸(11.94%)；同时，树莓籽油中含有丰富的β-谷甾醇，含量可达663.22 mg/100 g；生育酚中γ-生育酚和α-生育酚较多，含量分别达到799.248 mg/kg和602.996 mg/kg；多酚平均含量为(341.19±8.94)mgGAE/kg。树莓籽油中各种脂肪酸、甾醇、生育酚、多酚等成分相互影响，协同作用，共同发挥其重要的营养功能和降低血清胆固醇含量、增强细胞膜通透性、抗氧化等保健功能，符合现代人对健康天然的追求，使树莓籽油具有巨大市场前景。此外，本研究也有助于后续深入研究树莓籽油的营养保健功能及提取技术。

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