植物miRNA在中药物质基础研究中的应用

中央民族大学药学院，北京 100081

中药物质基础研究是阐明中药的药效物质、药理活性、作用机制和临床疗效的先决条件，也是直接影响中药单味药物和复方制剂开发、药物炮制工艺、剂型改进和质量标准制定的重要基础，也是中药现代化的重要研究内容和组成部分。中药物质基础和药效的研究已经有近80年的历史，目前，中药单味药和复方的药效物质基础研究成为国内外学者的研究热点，并且取得了很大的成就，如我国著名中药研究者屠呦呦从中药青蒿中提取到抗疟疾作用成分青蒿素，并获得了2015年的诺贝尔生理或医学奖，研究者在青蒿素的基础之上合成双氢青蒿素等近百种青蒿素衍生物，治疗和挽救了无数疟疾患者的生命[1]。

中药中含有的有效成分具有种类多，结构复杂，同时相互之间又有协同或拮抗作用，构成中药的多成分、多途径、多靶点的复杂体系，给中药的药效物质基础研究带来了巨大的困难和挑战。再加上中药物质基础研究浓厚的化学背景，从而促使大部分研究者把目光集中在对黄酮、皂苷等次级代谢产物的研究上，而忽略了对核酸、蛋白质等初级代谢产物作用的研究。虽然初级代谢产物大多为大分子物质，在消化道中被分解成为最小的基本单位被集体吸收利用，但部分小分子初级代谢产物可以以整体性形式被稳定地吸收进入体内并发挥其药理作用，这给中药的物质基础研究提供了新的研究思路和方法。

1 中药物质基础研究存在的问题

中药物质基础的研究思路与方法源于西方重视因果关系的哲学思想体系和对于植物化学研究，即对中药中有效成分进行提取、分离、结构鉴定、活性筛选等步骤进行物质基础研究以阐明其作用。中药研究采取此类研究方法对中药的化学成分和生物活性进行研究，揭示了一大批中药的物质基础，取得了重要的研究成果，如中国中医科学院的屠呦呦教授等发现青蒿素是青蒿中抗疟的主要有效成分、北京协和医学院陈克恢教授发现麻黄碱是麻黄利尿调节血压的主要有效成分[1-2]。目前对于中药物质基础研究主要集中于中药的次级代谢产物，虽然能够在很大程度上说明大部分中药的药物作用基础，但是仅从次级代谢产物药理作用分析的角度仍然难以对部分中药的药物作用物质基础进行合理解释。

目前大部分的研究集中于在次级代谢产物，对于初级代谢产物是否为中药作用物质基础的问题成为了研究的新方向。从生物化学的角度来看，外源性的蛋白质、脂质、核酸等初级代谢产物进入消化道后均被降解成为最基本的氨基酸、甘油、核苷酸等最小单位被吸入体内，如核酸的分解过程：外源性的核酸物质在生物体内在多种酶的催化下，水解生成核苷等小分子物质被吸收[3]，导致普遍认为蛋白质、脂质和核酸经消化吸收后就失去其生物活性。现有研究已发现外源性的植物miRNA可在人体内稳定存在，部分研究还发现一些中药的miRNA存在一定的药理活性。中药所含的植物miRNA是否是中药药物作用的物质基础，成为新的中药物质基础研究关注点[4-6]。

2 miRNA在人体内的存在

微小RNA(microRNA，miRNA)是由真核生物内源性发夹结构转录产物衍生而来的一种长19～25nt的单链RNA。miRNA可作为一种引导性分子通过碱基配对与靶mRNA结合从而在转录后引起靶mRNA的剪切或翻译的抑制，从而影响蛋白质的表达。研究表明，miRNA在不同调节途径中发挥关键作用，包括造血细胞的分化、细胞凋亡、细胞增殖以及肿瘤的形成等方面[7]，并发现miRNA与RNA病毒和DNA病毒在致病性及病毒与宿主的相互作用方面具有一定的作用[8-9]。目前对于miRNA的具体作用机制尚不清楚，主要由于miRNA与其靶mRNA形成一种复杂的作用网络。例如，一种miRNA可以结合并调节多种mRNA，与此同时，一个mRNA可与多个miRNA结合，故其作用机制复杂多样。miRNA的具体作用机制仍然是一个待解决的科学难题，对于miRNA的调节作用网络的研究尚处于起步状态。

外源性植物miRNA可以直接被哺乳动物从食物中吸收，并且在血浆和组织之中。Lin Zhang等在利用Solexesa测序法发现中国人的血浆中发现了十字花科植物的miRNA---MIR156a和MIR168a的存在，推测与中国人以水稻为主食的饮食习惯有关。实验利用RT-PCR和Northern Blotting技术对于这两种外源性植物miRNA的含量进行了测定，发现这两种外源性植物miRNA在人体血液中浓度很高，利用高碘酸对于血液中的外源性植物miRNA进行了进一步的处理测定，进一步验证了这两种miRNA在人体体内的存在。进一步研究miRNA的吸收过程，发现了miRNA是以整体形式通过被囊泡包裹吸收的形式经小肠吸收如体内[6]。Jonathan W. Snow等[10]进一步验证了外源性植物miRNA通过肠胃吸收进入人体，并以不同浓度存在于各个器官之中。Anna Lukasik等[11]发现在人类样本中的高丰度水平的MIR168a等基因，可以通过血乳屏障在猪的母乳中检测，并确定了其通过量的最大值。这些人体对于外源性植物miRNA吸收分布的研究为中药miRNA作为中药作用有效物质进入体内发挥药物作用的研究奠定了基础。

3 外源性中药miRNA的药理作用

甘草具有调节免疫等作用，能调和百药解百毒，更有“国老”之称、“十方九草”之说。目前对于甘草的增强免疫力作用效果的物质基础及其作用机制尚不清楚。邵红伟等[5]利用植物miRNA提取试剂盒从甘草水提物冻干粉中提取并纯化获得甘草miRNA，利用所提取的甘草miRNA作用于健康人血中分离的外周血单核细胞(PBMC)，从细胞形态变化、细胞数量鉴定细胞的增值情况以反应甘草miRNA对免疫细胞的影响。对比了甘草miRNA与甘草水提物、甘草酸、甘草次酸的对PBMC的影响结果表明，甘草miRNA组PMBC细胞出现明显的抱团现象，且抱团数量明显增多，证明了甘草miRNA对于PBMC的促进作用，为解释甘草的调节机体免疫功能的药效物质基础研究提供了新的证据。

向静等[12]利用从甘草水煎剂中提取的miRNA以及合成的甘草miRNA模拟物作用于PBMC，再一次证实甘草miRNA具有明显的免疫调节功能，并利用RT-PCR对其模式识别受体(PRR) 基因以及部分转录因子、信号分子和细胞因子的基因表达变化进行分析。结果表明，甘草miRNA对免疫细胞表面的一类模式识别受体TLR家族中的TLR1、TLR9表达上调作用，对TLR4和TLR8的表达则有下调的作用。甘草miRNA能够使得AP-1的重要组分c-JUN和c-FOS表达下降，说明其通过抑制AP-1通路来抑制Th2细胞分化。甘草miRNA还降低了NF-kB，p53和STAT1的表达，说明其可能抑制了炎症通路、凋亡以及Th1细胞的分化。值得关注的是，促炎因子IL-6的表达在miRNA组和总提物组相反，说明甘草水煎剂中成分和作用的复杂性，其整体作用效果可能是是由甘草miRNA与甘草所含次级代谢产物共同作用产生的。

金银花具有良好的清热解毒作用，广泛应用于各种病毒性感冒，但目前基于金银花抗病毒作用的次级代谢产物成分药效物质基础研究难以说明金银花的抗病毒作用。Zhen Zhou等[6]利用金银花水煎液中提取的miRNA2911分别进行体内和体外的抗病毒实验，发现其对于流感A类病毒具有广谱抗流感病毒作用，特别是H1N1、H5N1和H7N9病毒。该研究首先证明了miRNA2911能在金银花水煎液中稳定存在，并能够被人体吸收。根据金银花中miRNA2911的序列进行人工合成，利用合成的miRNA2911提取物对小鼠进行灌胃实验，在外周血及肺部中都能显著发现miRNA2911的存在，并利用无效的miRNA2911类似序列核苷酸进行抗病毒实验，发现其可以在体内检测到，但是无抗病毒效果。随后利用抗miRNA2911的核苷酸序列与miRNA2911同时灌胃，也无抗病毒效果。该研究直接证明了金银花的抗病毒作用的物质基础之一是其含有的miRNA2911。

4 讨论

中药miRNA的相关研究给中药作用物质基础研究提供了一个新的研究思路，药物的作用物质基础不仅仅局限于次级代谢产物也可能是核酸等初级代谢产物，这为中药的质量控制、新药开发等提供了一个新的研究方向。在中药作用物质基础研究方面，很多中药的次级代谢产物的体内体外实验都难以说明某些药物作用，如金银花的抗病毒作用等。这类问题可以尝试从miRNA的角度去建立研究方法。在药物开发上，如果发现某个中药的药效作用的有效成分是miRNA，则可以尝试使用PCR技术对于相应的miRNA片段进行扩增或者人工合成，制成注射剂、片剂等生物制剂，使得中药的衍生产品更加丰富，患者用药更加方便，药物生产效率，降低成本。在某些中药质量控制和药物炮制过程中，miRNA的种类和含量的改变同样值得关注。

虽然miRNA作为中药物质基础研究的前景十分可观，但是对于其后续的开发应用方面所涉及的问题仍然值得思考。miRNA的具体作用机制尚不完全清楚，其开发应用方面也必然会受到一定的限制。首先，中药所含的miRNA虽然被证明是中药药效作用的物质基础，但是miRNA本身是一种核酸，其制剂开发应用就会从中药资源开发转变成为基因治疗药物开发，不可避免会涉及基因治疗的伦理问题，必须衡量其实用性和风险性。其次，在应用的技术问题上，也存在许多问题，如目的基因表达可控性差、miRNA多靶点引起的副作用、使用剂量的考核、人体排出体外和体内积累等问题，其中最令人担忧的是长期安全性和耐药性的产生。

随着技术水平的不断提高，新发现和新理论的提出，都进一步深化了中药物质基础研究，但是目前面临的待解决的问题仍然很多。例如文章提出的“miRNA可能是中药药物作用新机制”的观点仍需要更多的实验研究证明，其后续相关研究仍有很多问题亟待解决，中药作用的物质基础仍需最大限度地运用现代相关技术进一步分析。

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