麦类作物花药离体培养特性遗传控制研究进展

赵林姝，刘录祥

(中国农业科学院作物科学研究所/国家农作物航天诱变技术改良中心/作物分子育种国家工程实验室，北京 100081)

花药离体培养技术在品种选育、DH遗传群体构建、突变体创制及转基因研究中发挥着重要作用。研究表明，花药离体培养胚状体和愈伤诱导、绿苗及白苗再生均是可遗传的数量性状，同时也受供体植株的生长环境、生理状态、花药预处理和离体培养条件等多种因素影响[1-3]。基因型依赖性和白苗再生是目前制约花药离体培养技术潜力充分发挥的主要因素[4-5]，解析这些限制性因素产生的原因是解决问题的关键。自20世纪70年代麦类作物花药离体培养体系建立后，各国学者相继利用非整倍体、代换系、易位系、双列杂交、细胞学及生理生化的方法开展了愈伤诱导、绿苗及白苗再生的遗传控制研究，初步揭示了控制愈伤诱导及花粉植株再生相关基因所在的染色体。随着分子生物学技术的发展，分子标记技术、基因克隆、转录组学及蛋白组学方法逐渐应用于花药离体培养各阶段的遗传研究，并取得一定进展。本文对国内外学者在麦类作物花药离体培养特性遗传控制解析方面的研究进行了综述，以期为克服花药离体培养基因型障碍等问题及提高花药离体培养效率提供一定参考。

1 花药离体培养过程中预处理效应的遗传控制

低温、高温、饥饿及渗透压等压力因素预处理均能使离体培养花药中的小孢子由配子体发育途径转变为孢子体发育途径，促使胚性小孢子重复分裂最终诱导产生单倍体胚状体和愈伤进而再生花粉植株[1]。研究发现，这些压力因素预处理诱导胚状体发育的效应相似，表明这些预处理的机制是非特异性的。

1.1 低温预处理

低温预处理是各种作物花药离体培养中普遍采用的预处理方式[5]。Iwona等[1]比较未经预处理及4 ℃低温预处理3周后小黑麦花药中的脱落酸(ABA)含量，发现低温预处理能使花药中ABA含量显著增加，进而增强离体培养初期小孢子抗氧化系统的活性，维持离体培养过程中小孢子的活力。低温预处理能显著增加过氧化氢的积累，维持抗氧化酶的活性能力，同时也保护细胞免受活性氧(ROS)的毒性影响，抗氧化酶的作用是高活性的非酶抗氧化剂无法取代的；低温产生的信号启动小孢子发育途径的转变，是获得高效胚状体形成能力的重要因素[6]。Krzewska等[7]对4个具有不同再生能力的小黑麦DH系的花药进行低温处理，分析处理前后花药的蛋白组学，发现低温处理能增加抗氧化应激的细胞防御蛋白(如抗坏血酸过氧化物酶)、细胞伴侣(如HSP70)、蛋白质生物合成相关酶及细胞分裂相关蛋白的积累，从而引发小孢子的胚胎发育。

1.2 甘露醇预处理

甘露醇预处理对胚状体诱导及绿苗再生具有较好的效果[8]。Maraschin等[9]利用cDNA宏阵列的方法研究了甘露醇预处理大麦花药后启动小孢子由配子体发育途径转向孢子体发育路径的分子机制，发现正常发育的单核及双核小孢子中表达的细胞分裂相关基因以及参与脂类生物合成、淀粉合成及能量合成的转录产物，在经甘露醇处理4 d的小孢子中均表达下调，说明甘露醇预处理能阻碍花粉发育相关基因的表达；糖和淀粉水解、蛋白水解、应激反应、程序性细胞死亡抑制和信号转导相关产物的上调表达是甘露醇预处理诱导胚状体发育的标志，分析显示，小孢子离体培养胚状体发育的潜力和编码乙醇脱氢酶3、金属蛋白酶基因、半胱氨酸蛋白酶1前体、天冬氨酸蛋白酶及26S蛋白酶体调节亚单位基因的诱导有关 。Munoz-Amatriain等[10]利用22K大麦芯片对甘露醇预处理前后花药的转录组学进行研究，发现了2 673个差异表达基因，其中887个基因上调表达，1 786个基因下调表达；转录因子分析显示，多数下调表达的转录因子与生长和发育相关，上调表达的转录因子多与非生物及生物逆境有关，多数细胞周期相关基因没有变化。

1.3 硫酸铜预处理

硫酸铜是小孢子离体发育的必须元素，硫酸铜的缺失会使叶绿素含量降低[11]。Jacquard等[4]对硫酸铜预处理后大麦花药中小孢子细胞超微结构进行研究，发现10 μm硫酸铜预处理后Igri 和Cork两个基因型离体培养28 d的胚状体中质体密度分别较小孢子提高3倍和2倍，未经硫酸铜预处理的小孢子和胚状体中质体密度无差异；离体培养28 d后，质体基质中淀粉数量减少，类囊体和原片层体发达，并据此认为硫酸铜能促进小孢子中质体分裂及内膜的平行发育，诱导淀粉体发育成前质体，之后进入叶绿体发育进程。

1.4 子房共培养

研究表明，子房预处置培养基的应用及子房共培养可使面包小麦花药离体培养产生的胚状体数和分化绿苗数分别增加6倍和11倍，尤其对低花培力基因型效果明显[12]。对不同基因型或不同发育时期的子房共培养，能显著提升小孢子的胚胎诱导效率；与含有单核中晚期小孢子的花序子房比较，含有双核期小孢子的花序子房可使产生的胚状体数和分化绿苗数提高25%～46%。对子房预处置培养基及子房共培养提高胚状体诱导率及绿苗再生率机制的基因表达分析显示，TAA1b、FLA26、WALI6基因和小孢子胚胎发生相关，CGL1基因(与多聚糖合成和降解相关)和FER基因(和子房信号传导过程相关)在子房共培养过程中也均有不同程度的表达和诱导[12]。

2 花药离体培养过程中胚状体或愈伤诱导效应的遗传控制

花药离体培养再生花粉植株一般经过2个过程，首先是花药中小孢子脱分化形成胚状体或愈伤，之后是胚状体或愈伤分化再生花粉植株，其中小孢子脱分化形成胚状体或愈伤是形成再生花粉植株的先决条件。研究表明，基因型是影响花药离体培养胚状体或愈伤形成的主要因素，不同基因型间花药小孢子脱分化形成胚状体或愈伤的能力差异显著，遗传控制复杂，可能存在多种遗传学效应[13-16]。

2.1 小 麦

关于小麦花药离体培养愈伤诱导是否存在细胞质效应，不同研究者因试材不同得出的结论也存在差异。有研究表明[17]，小麦品种间互交，母本效应很弱或不存在，而Ekiz等[18]和Yildirim等[19]则发现存在明显的细胞质效应。Chaudhary等[20]通过对9个冬小麦基因型和2个春小麦基因型利用不完全双列杂交方式获得的F1代及其亲本花药培养特性的研究表明，愈伤诱导以非加性效应为主。Ekiz等[18]分析了4个基因型完全双列杂交组合后代的花药培养特性，发现愈伤诱导率的遗传差异占总差异的92%，愈伤诱导率的一般配合力方差为74%，狭义遗传力的估计值为0.68。小麦胚状体或愈伤诱导能力控制基因染色体定位的研究也取得了一定进展， Szakfics等[21]采用中国春代换系的研究表明，7A和1A染色体与小麦愈伤诱导能力相关；Agache[22]利用非整倍体、代换系和易位系的研究表明，中国春的1D和5BL染色体基因增加了胚状体的诱导效率；Nielsen等[23]采用SSR和DArT分子标记技术，对小麦杂交F3群体开展了花药小孢子的定位研究，分别在5A和5B染色体上检测到2个可解释41%愈伤诱导能力变异的QTL。

2.2 大麦

大麦花药离体培养胚状体诱导的一般配合力和特殊配合力是相互独立的，遗传差异既存在加性效应，也有显性效应，但加性效应更为重要[13,15]。Manninen等[24]采用RAPD、RFLP和SSR分子标记技术对六棱春大麦Rolfi和 Botnia构建的DH群体进行初步定位，发现了2个与大麦愈伤诱导相关的QTL，分别位于2H和4H染色体。Chen等[25]采用RAPD、STS和SSR分子标记技术，也在2H染色体上检测到了与胚诱导相关的QTL，该位点可解释表型变异的40.92%，并在另外一个染色体6H上也检测到1个相关的QTL，这个位点可解释表型变异的11.54%。通过cDNA克隆方法在大麦花药小孢子离体培养胚胎发育早期获得了ECA1、ECGST、ECLTP三个表达基因，其中ECA1只在离体培养早期表达；ECGST与谷胱甘肽S-转移酶成分parA-like基因同源，其编码蛋白可能在离体培养过程中应对氧化应激压力的保护细胞中发挥重要作用；ECLTP基因和脂质转移蛋白基因同源且表达模式类似，脂质转移蛋白被认为是胡萝卜体细胞胚胎发育中早期胚胎形成的标志[26]。

2.3 小黑麦

采用AFLP、SSR及DArTs等分子标记技术的研究表明，6B和4R染色体存在2个可解释小黑麦胚状体诱导表型变异30%的QTL[27]，5A、4R、5R 和7R染色体存在7个与愈伤诱导相关的QTL[28]。对8个小黑麦DH系雄核发育反应的生理学研究表明，内源和外源激素水平的平衡是雄核有效发育的保障；IAA含量和胚状体的诱导呈显著的负相关，低水平生长素有利于胚状体的形成和绿色植株再生能力的提高；玉米素与胚状体形成的能力呈正相关[29]。高的过氧化物歧化酶(SOD)活性直接决定小孢子的生存能力，小孢子胚状体形成能力和过氧化氢的产生呈非线性正相关，与过氧化氢酶呈负相关，一定水平的过氧化氢酶阈值对胚状体的形成至关重要[6]。Krzewska等[7]通过对4个具有不同再生能力小黑麦DH系的蛋白组学分析，初步认为烯醇化酶和12S贮藏蛋白可以做为花药离体培养早期胚胎发育的候选标记。

3 花药离体培养过程中绿苗再生效应的遗传控制

花药离体培养再生的花粉植株分为绿苗和白苗2种，其中白苗由于叶绿素缺失无法进行光合作用，不能正常生长发育成熟，苗期即停止生长。花药离体培养再生的花粉绿苗其染色体数与配子细胞一致也为单倍体，不能结实形成种子，需经过离体培养过程或苗期的自然或人工加倍才能形成正常结实的双单倍体植株，由于这些加倍形成的双单倍体植株每对染色体上的成对基因均为纯合基因，自交产生的后代不会发生性状分离，可在育种工作中应用以加快新品种选育进程。

3.1 小麦

小麦花药离体培养绿苗再生正反交效应显著[18-19]，且以加性效应为主[20]。对4个小麦基因型完全双列杂交组合后代花药培养特性的研究表明，绿苗分化率及绿苗产率的遗传组分分别占总变异的80%和77%，绿苗再生及绿苗产率的一般配合力方差分别为66%和53%，其狭义遗传力的估计值分别为0.54和0.43[20]。小麦绿苗再生控制基因染色体定位的研究也取得了一定的进展，Lazaridou等[30]通过比较六倍体和四倍体小麦基因型的花药离体培养特性，认为D基因组是绿苗分化所必须的。利用中国春代换系发现3A染色体与植株再生相关，2D染色体和绿苗再生相关[21]。利用非整倍体、代换系和易位系发现位于中国春的1RS染色体上的基因增加了花粉植株再生能力[22]。采用AFLP分子标记技术对50个DH群体进行基因定位，发现了4个与绿苗再生相关的QTL(QGpp.kvl-2A、QGpp.kvl-2B、QGpp.kvl-2B和QGpp.kvl-5B)，分别位于2AL、2BL和5BL染色体，这4个QTL对绿苗分化率表型变异的贡献率之和为80%，其中5B染色体上的位点可解释31.5%的表型变异[31]。而采用SSR和DArT分子标记技术对小麦杂交F3群体花药植株再生频率进行定位研究，分别在1B和7B染色体检测到2个可解释53%绿苗再生能力变异的QTL，其中1B染色体上的位点可解释34%的绿苗再生能力变异[23]。

3.2 大麦

基因型是影响大麦花药再生绿苗的主要因素，其效应占总变异的60%以上。核基因可以解释全部的遗传效应，未发现有核质互作效应。一般配合力可以解释杂交种绿苗形成的全部遗传变异[13]。Manninen等[24]利用RAPD、RFLP和SSR分子标记技术对六棱春大麦Rolfi和 Botnia构建的DH群体进行的定位研究，发现2H和3H染色体存在3个与花粉植株再生相关的QTL，其中2个位于2H染色体。Chen等[25]利用RAPD、STS和SSR分子标记技术在另外2个染色体上(5H和6H)检测到QTL， 其中6H染色体的位点可以解释表型变异的32.68%，5H和6H染色体的QTL可解释绿苗再生表型变异的50.53%。Munoz-Amatrian等[32]采用AFLP分子标记结合RAPD、STS和SSR标记的方法对100个DH系进行研究，发现了2个与大麦绿苗再生相关的QTL，分别位于3H和5H染色体，可解释表型变异的65.2%；进一步利用30个不同来源大麦优良品种对发现的QTL进行验证，其中位于3H染色体的SSR标记HVM60，与绿苗再生率呈显著相关，可解释表型变异的20%。

3.3 小黑麦

Krzewska等[28]采用DArT、AFLP及SSR分子标记技术对含有90个DH株系的小黑麦群体的花培力基因定位研究表明，与花粉植株再生相关的QTL位于4A染色体上。低水平生长素有利于绿色植株再生能力的提高，玉米素与胚状体再生植株的能力呈正相关[33]。

4 花药离体培养过程中白苗再生效应的遗传控制

质体是叶绿体合成及进行光合作用相关代谢的细胞器，与花粉白苗的产生关系密切。有研究认为，核、质体单独或相互作用促使了白苗的再生，并在白苗质体基因组中发现了基因组的缺失和翻译错误[33]。

4.1 小麦

小麦花药离体培养白苗再生的正反交效应差异不显著[19]。通过非整倍体、代换系和易位系研究发现，中国春5B染色体具有增加白苗再生效率的基因[22]。采用SSR和DArT分子标记技术对小麦杂交F3群体花粉植株再生频率进行定位研究，在 1B和7B染色体检测到2个增加白苗再生的QTL，可解释55%的表型变异[23]。通过对石麦15基因型花药离体培养再生的白苗及绿苗的RNA-Seq及蛋白组学的比较分析，发现绿苗和白苗间的差异基因主要和光合作用、卟啉及叶绿素新陈代谢路径相关，且多数差异表达基因参与类囊体和叶绿体被膜的构建，对其中12个差异表达基因进行实时荧光定量PCR分析，验证结果与RNA-Seq结论一致；绿苗和白苗间的差异蛋白主要与和抗氧化剂、结合、转运、结构分子和催化活性相关[34]。

4.2 大麦

Dunford等[35]对大麦花药离体培养产生白苗的质体基因组结构及相关的转录水平进行研究， Southern分析显示，4株白苗质体基因组存在特定限制片段(AptDNAs)的缺失或改变，但有1株白苗质体基因组是完整的；所有白苗植株的DNA含量均减少，而相应绿苗叶片中含量为6%～20%。白苗核基因和质体基因编码的质体成分的Northern blot结果显示，与绿苗相比，白苗中未检测到rbcL、psbD-psbC、16S和23SrRNAs基因的转录或转录水平很低；白苗中编码叶绿体蛋白的核基因rbcS和cab的转录水平也很低。非质体成分的核编码的25SrRNA在绿苗和白苗中表达水平一致，说明白苗中只有质体相关基因表达受影响。白苗中质体基因转录水平的降低与质体DNA变化的不同形式无明显相关性。Caredda等[36]对冬大麦品种Igri(绿苗再生频率为87.8%)和4个春大麦品种(只再生白苗)离体培养花药进行了质体超微结构研究，发现这2种类型的小孢子质体发育表现为2个完全相反的路径，Igri品种花药离体培养过程中质体具有较多分化的类囊体，淀粉数量较少，含有DNA的质体比例较高；与此相反，4个春大麦品种花药离体培养过程中，质体的类囊体中含有分化不充分的造粉体，质体中DNA含量较少，认为造粉体的出现是分化白苗的标志，质体的发育路径早在小孢子发育时期就已经确定，并推测是早期花粉发育过程中质体DNA的降解引起了白苗的分化。

4.3 小黑麦

Krzewska等[37]关于90个小黑麦DH群体的定位研究显示，3B、4B、4R、5R和7R染色体存在7个与白苗再生相关的QTL，这些QTL可解释8.3%～17.6 %的白苗分化表型变异。进一步利用10个DH系研究了白苗再生能力与各种内生激素含量、氧化应激及抗氧化能力的相互关系，认为一定程度的氧化应激是从非光合能力的质体转化为叶绿体所必需的，同时高效的抗氧化酶系统和内源激素平衡也很重要。

5 问题与展望

花药培养技术在新品种选育中发挥着重要作用，国内外利用花药培养技术已选育出一批大麦、小麦等作物新品种并在生产上应用。花药离体培养特性主要受遗传因素决定，但同时也受外植体生长条件及花药离体培养条件的影响。目前不同作物的花药培养效率差异较大，其中大麦花药培养体系已趋于成熟，分化胚状体及再生花粉植株能力较强，而小麦、玉米及水稻的花药离体培养效率还有待进一步提高。受花药离体培养表型性状鉴定效率及准确性的制约，花药培养特性遗传机制的研究受到了一定程度的限制，关于花培特性遗传控制的细胞学、生理生化、DNA、RNA及蛋白等水平的研究还相对较少。大麦是目前花培体系构建比较成熟的作物，同时因大麦是二倍体植物，且基因组测序已完成并已组装成了1个包含4.79 Gb的大麦高质量参考基因组序列，因此，以大麦为研究对象开展花药培养特性的基因定位及克隆等研究、解析基因表达网络同花药培养性状之间的关系更易取得突破性进展，在此基础上再进一步延伸至小麦等其他作物可能会有更好的效果。总之，今后的花药培养特性机制解析研究要在提高花药培养特性表型性状鉴定准确性的基础上，与不断发展的现代生物学技术相结合，充分利用最新的先进技术开展相关研究工作，为克服花药离体培养的基因型依赖性等问题提供解决办法，进而提高花培育种的效率，为农业生产服务。