蜂胶与杨树胶鉴别

张翠平 黄帅 胡福良│文

浙江大学动物科学学院，杭州310058

蜂胶生产受胶源植物、蜂种、采胶方式、季节、气候条件以及生产过程等多种因素的影响，产量相对有限。蜂胶原料的紧俏和利益的驱动，促使一些不法厂家用杨树芽熬制出杨树胶掺入到蜂胶中或直接以杨树胶冒充蜂胶，并加入类黄酮类物质，人为地提升总黄酮含量，达到以次充好的目的。蜂胶掺杂使假现象愈演愈烈，真蜂胶的价值难以体现，蜂农、蜂胶加工企业及消费者的权益难以保障。

杨属（Populus）植物是杨属型蜂胶的植物来源，近年来，蜂胶与杨树胶鉴别研究成为蜂胶质量控制研究的热点。研究者尝试通过液相色谱法、气相色谱质谱法、红外光谱法、热分析法等现代分析分离技术以及蜂胶与杨树胶的化学成分对比研究等多种方法来鉴别蜂胶与杨树胶。本文对国内外蜂胶与杨树胶鉴别研究进展按照鉴别方法及鉴别指标作一介绍。

1 液相色谱法（HPLC）

液相色谱指纹图谱近年在蜂胶与杨树胶鉴别方面发挥了重要作用。周萍等（2009）测定了蜂胶、杨树胶和掺假蜂胶的H PLC指纹图谱，发现蜂胶含有2个杨树胶不含有的特征峰，杨树胶中含有1个蜂胶中不含有的特征峰。他们对不同产地来源的62个蜂胶样品建立H PLC指纹图谱，将蜂胶图谱分为6个区域，提出了以第四区的1号峰、2号峰、5号峰为蜂胶鉴别的主要依据，结合6个区域的指纹图谱进行真伪鉴别。李樱红等（2014）建立了区分蜂胶与杨树胶的H PLC指纹图谱，以对照模板为参照，通过《中药指纹图谱相似度计算软件》计算，对蜂胶、杨树胶、蜂胶中掺杨树胶、蜂胶中掺外源性黄酮类化合物、既非蜂胶又非杨树胶等样品的相似度范围进行了限定。该方法可以鉴别出杨树胶掺假量40% 以上的样品。

潘建国等（2002）采用液相色谱法在蜂胶中检测到10-羟基-2-癸烯酸（10-HDA），含量大约为0.22%。10-HDA是由蜜蜂上颚腺分泌的一种蜂王浆中所特有的高效生物活性物质，蜜蜂有可能在采胶的过程中加入了该物质。然而他们仅测定了3个样本，是否所有蜂胶中都含有10-HDA，含量多少等都有待进一步研究。盛文胜等（2008）用液相色谱法对蜂胶与杨树胶中肉桂酸含量进行研究，发现真假蜂胶中肉桂酸的含量存在差异。但是，由于不同地区采集的蜂胶即使同一成分含量差异也较大，对此还需要进行大样本研究才能确定其可行性。

张翠平等（2011）采用HPLC建立区分蜂胶与杨树胶的指纹图谱，8个不同地区蜂胶的H PLC指纹图谱十分相似，与杨树胶表现出不同的指纹图谱特征。其中，蜂胶中2个共有峰是杨树胶中没有的特征指纹峰，而3个不同来源的杨树胶中有3个共有峰是蜂胶中没有的特征指纹峰，且这5个特征峰明显，相互间没有干扰，易鉴别。

王小平等（2009）研究发现，蜂胶与杨树胶主要化学成分基本相同，只是相对含量有所不同，并建立了蜂胶指纹图谱分析方法，确定有13个共有峰，其中4个成分为已知成分，而10批蜂胶中8号峰和10号共有峰的峰面积甚微，而在杨树胶中这两个峰均较高，认为这两个峰的明显程度可以进行蜂胶与杨树胶的鉴别。但该方法样本量小，需收集不同产地大量的样品进行系统研究。

刘莉敏等（2014）对9个国内外蜂胶样品75 %热乙醇提取液用超高效液相色谱四级杆飞行时间质谱联用仪（UPLC-Q-TOF-MS）进行了一级阳离子化[M+H+]总离子流色谱（TIC）和总质谱（色谱和质谱指纹）的采集分析。从TIC指纹中发现，2个广东成品蜂胶色谱指纹与其余7个极为不同，判断为异常蜂胶；9个蜂胶样品均未检出芦丁和槲皮素。总质谱指纹主成分分析结果表明，2个异常蜂胶的判别与色谱指纹结果一致。由于色谱指纹图谱以“整体性”和“模糊性”为特点，在没有具体指标成分参考条件下，在不同检测条件下图谱很难完全重复，这给方法的推广应用带来困难。

张翠平等（2014）采用反相-高效液相色谱法（R P-HPLC）开发出了一种同时分析中国蜂胶12种黄酮类和8种酚酸类化合物的方法，并成功将其应用于中国蜂胶的质量控制。分析结果显示，香草酸、芦丁、杨梅酮和木犀草素在所有分析的蜂胶和树胶样本中均未被检出；而咖啡酸、阿魏酸和p-香豆酸仅在蜂胶中检出，而杨树胶样本中并未发现，提示这几种化合物可作为区分蜂胶与杨树胶的标志性成分。此外，杨树胶的黄酮类化合物图谱同蜂胶相近，短叶松素、松属素、3-O-乙酰基短叶松素、柯因和高良姜素是其中的主要成分。因此，此方法可将咖啡酸、阿魏酸和p-香豆酸用于区分蜂胶和杨树胶的定性指标，通过短叶松素、松属素、3-O-乙酰基短叶松素、柯因和高良姜素含量的多少，在一定程度上判断中国蜂胶质量的优劣。

2 气相色谱与质谱联用（GC-MS）

由于蜂胶中含有大量的挥发性成分，因此有关蜂胶与杨树胶中挥发性成分的对比研究也较多。余兰平等（2006）采用气相色谱-质谱联用方法研究发现，蜂胶中芳香酸、醇及酯类物质的含量明显高于杨树胶，杨树胶中总黄酮和萜烯类化合物的含量略高于蜂胶。蜂胶和杨树胶中苯甲醇、3,4-二甲氧基肉桂酸、3-苯基-2,3-二甲基环丙烯、2,6-二羟基-4-甲氧基查耳酮和柯因的含量有比较大的差异，反油酸、1-(3-甲氧苯基)乙酮、4-乙酰基安息香酸苯基甲基酯只在蜂胶中存在，并且含量在1%以上，4-羟基-3-甲基苯乙酮和佛手油烯在杨树胶中存在，而在蜂胶中不存在。

程焕等（2012）分别采用固相微萃取法（S P ME）、动态顶空（D H S）对蜂胶和杨树胶挥发性成分进行提取，经气相色谱-质谱联用（G C-MS）法结合计算机检索对其挥发性成分进行分析和鉴定。结果发现，蜂胶中的酯类物质（乙酸-3-甲基-3-丁烯-1-醇酯、3-甲基-2-丁烯-1-醇甲酸酯、乙酸-3-甲基-3-丁烯-1-醇酯、3-甲基-2-丁烯酸-2-苯乙酯、壬酸乙酯、月桂酸乙酯、棕榈酸乙酯）、醇类物质（3-戊烯-2-醇、3-甲基-2-丁烯-1-醇、α-桉叶醇）、萜烯类物质（β-葎草烯、雪松烯）、烯烃类物质八氢二甲基-2-(1-亚异丙基)萘在杨树胶中均未检测到。而杨树胶中醇类物质(+/-)-α-红没药醇、烯烃类物质α-姜黄烯2,6,6,9-四甲基-三环[5.4.0.0(2,8)]-9-十一烯也未在蜂胶中检测到。

王向平等（2012）以气相色谱-质谱联用仪分别对蜂胶和杨树胶的化学组分进行了分离鉴定，蜂胶中共鉴定出75 种物质，杨树胶中共鉴定出71种化合物。蜂胶和杨树胶中的2,6-二羟基-4-甲氧基查耳酮、高良姜素和柚木柯因的含量有明显差异。3,4-二甲氧基肉桂酸、棕榈酸、1-二十六烷醇、1-十九烯只在蜂胶中存在并且含量均高于2%，愈创木醇、1-甲基-4-(6-甲基-5-庚烯-2-基)苯、2-苯基苯并咪唑在杨树胶中存在而在蜂胶中不存在。因此，可通过检测愈创木醇、1-甲基-4-(6-甲基-5-庚烯-2-基)苯、2-苯基苯并咪唑是否存在于蜂胶中来鉴别蜂胶中是否掺入了杨树胶，而通过检测2,6-二羟基-4-甲氧基查耳酮、柚木柯因和高良姜素的含量来确定蜂胶的真伪和掺假程度。

电子鼻是根据仿生学原理，由传感器阵列和自动化模式识别系统所组成，是一种新颖的分析、识别和检测复杂气味和大多数挥发性成分的仪器，已经用于食品的等级划分与新鲜度检测。延莎等（2012）用电子鼻对来自中国17个省份的71个蜂胶样品及其杨树胶进行测定，通过主成分分析，可以较好地区分蜂胶和杨树胶。董捷等（2008）利用电子鼻对中国14个省市及掺假蜂胶共52个样品进行分析，通过电子鼻对蜂胶芳香特征的响应实验，可以得出电子鼻对蜂胶的芳香成分有明显的响应，并且每一个传感器对蜂胶的响应各不相同。应用电子鼻的几类传感器，针对几类特定的物质（而不是几种物质）进行分析，并对所得的结果应用主成分分析方法（P C A）进行处理，能够鉴别掺假蜂胶。但在该实验中，也存在几个地区的蜂胶样品难以区分的情况。因此，对于利用电子鼻鉴别真假蜂胶技术还有待进一步深入研究和完善。

延莎等（2012）采用气质与嗅闻仪结合的方法，分析了3种蜂胶样品和杨树胶的气味活性成分，共鉴别出48 种气味活性成分，包括酯类、醛类、醇类和酸类化合物。结果表明，形成蜂胶的气味活性成分中具有更多的花香、果香物质，如梨醇酯、糠醛、苯甲醛等化合物，使蜂胶具有更为清香、柔和的总体气味特征，而杨树胶呈现出的整体气味较蜂胶更为刺鼻、尖酸，可以考虑从气味特征上对蜂胶与杨树胶进行识别。

由于不同来源的蜂胶中挥发性成分差异较大，至今还未形成有效的基于蜂胶中挥发性成分的蜂胶与杨树胶鉴别的标准方法。

3 红外光谱法（IR）

由于红外光谱图具有整体性、特征性和模糊性的特点，可以作为复杂混合体系鉴别与质量监控的快速、有效的方法，因此红外光谱法是应用于蜂胶真伪鉴别较为可行的一种技术，但其实验结果受样品处理的影响容易产生假象。

Wu等（2008）使用傅里叶变换红外光谱和二维红外光谱联用对不同地区蜂胶及杨树芽分泌物进行分析，发现它们之间具有相似的红外谱图，二者的差异在于长链烃基化合物的不同（包括长链烷烃、长链烷基酯和长链烷基醇）。蜂胶提取物比杨树芽提取物中长链烷基类化合物更多，这些化合物中碳原子呈Z形排列，而杨树芽提取物中是不规则的。龚上佶（2011）研究发现，树胶与蜂胶的光谱图差异显著。所有蜂胶在基团频率区存在两个特征峰区域，分别是2848.53～2849.08和2916.76～2917.74（为烷烃的特征峰），而树胶在这两个区域不存在特征峰；杨树胶特征峰集中在1150～1300（为醇、酚及醋类的特征峰）和1550～l650（为亚硝基、酞胺及烯烃的特征峰）两个区域，而蜂胶在1800～4650间存在很多特征峰。这两方面的差异可用于区别蜂胶与树胶。X u等（2013）利用傅里叶变换近红外光谱法（FT-NIR）对中国蜂胶中掺入杨树胶进行检测。首先针对树胶掺假建立了偏最小二乘数学模型，并采用偏最小二乘回归方程对树胶含量进行定量分析，其结果也证实，采用FTNIR光谱结合化学计量学方法可以对中国蜂胶中树胶掺假进行快速检测。

4 热分析法（TA）

热分析法是在程序控制温度下，准确记录物质理化性质随温度变化的关系。付阳等（2006）采用热分析法对蜂胶和杨树胶的DSC-T G曲线的特征区间进行比对，结果发现，T G曲线分为两个阶段：100～300度为第一阶段，是小分子的分解，蜂胶的失重率为47.72%，杨树胶的失重率为32.69%；340～700度为第二阶段，为大分子的降解，蜂胶的失重率为47.29%，杨树胶的失重率为54.86%。而DSC曲线中，蜂胶在333.0度有一个吸收峰，在503.0度有一个放热峰。杨树胶在314度有一个吸收峰，在478.0度有一个放热峰。通过比较发现，在第一失重阶段，蜂胶的小分子有机物含量比杨树胶高15%，而第二阶段，蜂胶的失重较为缓慢，为黄酮类混合物的降解，杨树胶具有典型的高分子聚合物的特征。从两者的残碳率来看，蜂胶几乎为零，杨树胶为7.48%。但该方法并未形成有效的检测方法得以应用。

5 薄层色谱法（TLC）

薄层色谱法是将适宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上，成一均匀薄层，待点样、展开后，根据比移值与适宜的对照物按同法所得的色谱图的比移值作对比，用以进行鉴别的方法。Tang等（2014）采用薄层色谱法来区分蜂胶和杨树胶。结果表明，采用相似度、分层群聚、k-means聚类、神经式网络、 支持向量机等分析手段，能够将蜂胶与杨树胶区分开。

6 以叶绿素为指标

找寻蜂胶与杨树胶明确的差异成分用以二者的鉴别，是研究者最感兴趣的，也是最理想的鉴别方法。

周立东等（2007）利用光谱法对比蜂胶与杨树叶、杨树芽中叶绿素含量的差别，发现测定的11个蜂胶样品中均不含叶绿素，杨树叶提取物中叶绿素含量较高，杨树芽50%乙醇提取物中含有叶绿素，但含量较低，杨树芽95%乙醇提取物中未能检出叶绿素，杨树胶中也未检测到叶绿素。该方法可以鉴别直接掺入杨树叶或杨树芽粉末的假蜂胶，以及各种含叶绿素杂质的掺假蜂胶，但不能排除其中掺有杨树芽高极性溶剂提取物的可能。

杨茂森等（2012）根据相似相溶原理，利用极性较低有机溶剂对蜂胶及杨树（芽）胶中叶绿素类物质进行溶解、分离萃取，通过分光光度法进行定量对比检测，发现蜂胶中叶绿素平均含量为6.73 m g/100 g，提纯杨树（芽）胶中叶绿素平均含量为111.2 mg/ l00 g，两种不同胶体叶绿素含量差异十分明显；在蜂胶中按不同比例掺入杨树（芽）胶进行回收检测试验，发现杨树（芽）胶掺入量与叶绿素的增加量呈线性关系。

7 以水杨苷和邻苯二酚为指标

杨属植物的特征性成分是酚苷，以水杨苷、柳皮苷、2’-苯甲酸水杨苷和特里杨苷含量较为丰富。国内外有关蜂胶化学成分的研究很多，从蜂胶中分离鉴定出了500多种成分，但迄今为止尚未有蜂胶中存在任何酚苷的报道，而很多研究曾报道过蜂胶中含有水杨酸及乙酰水杨酸等衍生物。杨属植物中发现的酚苷均以β-葡萄糖苷形式连接，β-葡萄糖苷酶可催化水解结合于末端非还原性的β-D-糖苷键，同时释放出配基与葡萄糖体。张翠平等（2011）首次在新鲜蜂胶的酶提取液中检测到β-葡萄糖苷酶活力，并证实该酶能够水解芳香基β-D-葡萄糖苷，与Pontoh等（2002）从西方蜜蜂体内分离纯化得到的β-葡萄糖苷酶性质相符。因此，推测蜜蜂在采集蜂胶以及蜂巢内传递蜂胶的过程中已将酚苷水解。

杨属植物有100多种，主要分布在温带和亚热带地区。水杨苷是酚苷的基本结构单元，是更高级的水杨酸盐类衍生物的主要降解产物之一，在所有研究过的杨属植物的皮、叶、花，芽中均有分布。张翠平等（2011）用高效液相色谱法优化了杨树芽中水杨苷的测定方法，在蜂场周围分布较多的北京杨和加拿大白杨的叶子和芽中均检测到水杨苷存在；在随机购买的11个杨树胶样本中也均检测到水杨苷的存在；而在蜜蜂采集回蜂箱内5 d、10 d、15 d、20 d 及30 d 的蜂胶样本中均未检测到水杨苷的存在。以上事实支持蜜蜂在采集加工蜂胶过程中已将水杨苷水解，而在杨树胶制作过程中水杨苷稳定存在，证明了以水杨苷为参照鉴别蜂胶与杨树胶的可行性。除了水杨苷特征峰，还有一个未知成分（峰A）在所有杨树胶样本中存在，而在蜂胶中不存在，该未知成分经黄帅等（2014）分离鉴定为邻苯二酚。它在所研究的杨属植物的芽、叶、花、皮中均有分布，其物理性质极其稳定，可在甲醇、酸性、碱性以及中性介质中均能稳定存在。在存在多酚氧化酶的条件下，邻苯二酚可被氧化为1,2-苯醌，但其所需的氧化酶应具有较强的特异性，即可以氧化具有邻位二羟基的多酚类化合物。黄帅等（2014）首次在蜂胶中检测到了多酚氧化酶的活性，并且证明了蜂胶中的多酚氧化酶来源于胶源植物，并非蜜蜂自身腺体所分泌。该酶天然状态下处于未激活状态，在蜜蜂采集加工蜂胶时，破坏植物组织后才能将其激活，从而使杨树芽中的邻苯二酚化合物氧化为邻苯二醌，消失于蜂胶中。随后，通过对国内外大量蜂胶样本的检测验证，证实了以水杨苷和邻苯二酚为指标鉴别蜂胶与杨树胶的方法是完全可行的。以水杨苷和A蜂（CCP）为指标的蜂胶中杨树胶的鉴别方法于2012年7月9日批准为行业标准（G H/T1081-2012），以水杨苷和邻苯二酚为指标的蜂胶中杨树胶的鉴别方法于2017年11月1日批准为国家标准（GB/T34782 -2017），成为法定的蜂胶与杨树胶的鉴别方法。