深圳地区250例地中海贫血基因检测结果研究

李智文

资料显示［1］, 地贫广泛分布于世界各地区, 东南亚为地贫高发地区。地贫尚无较理想的治疗方案, 通过预防监控并及时采取干预措施是目前的一种重要手段, 关键环节在于筛查婚前育龄男女, 降低地贫患儿的出生率。本研究通过常规筛查试验、RDP、Gap-PCR、巢式PCR及PCR-SBT技术对250例地贫患儿的基因检测结果进行分析, 现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 以2016年6月～12月来本院进行筛查的疑似地贫儿童3065例为研究对象。纳入标准：家族中有地贫患儿、地贫基因携带者；每分钟最大通气量(MVV)＜80 fl。排除有其他血液系统疾病者。本研究符合本院伦理学标准,经伦理委员会批准, 纳入研究对象及家属均知情且同意参与研究。3065例受检者中有女1368例, 男1697例；年龄1个月～15岁, 平均年龄(2.5±4.2)岁。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 抽取研究对象2 ml的肘静脉血, 试管中有抗凝剂乙二胺四乙酸(EDTA)二钾, 血液标本于常温条件下保存以备检验。

1.2.2 血常规检查 借助XE-2100型分析仪检测研究对象的血样, 操作流程严格遵照仪器说明书, 对血红蛋白(Hb)、红细胞比容(HCT)、红细胞平均体积(MCV)、红细胞(RBC)等指标进行测定。参照文献［2］中相关内容对检查结果进行分析。不管受使对象MCV正常与否, 均照常行Hb电泳与RBC脆性检测。

1.2.3 Hb电泳、RBC脆性检测 参照叶应妩等［3］编制“临床检验操作流程”中的相关操作标准, 借助毛细管电泳仪对血液标本行Hb电泳分析；在一定电压、缓冲液的条件下,8条石英毛细管并联行Hb电泳, 在波长415 nm处测定血红蛋白A2(HbA2)水平；注意在电泳分析时, 对厂家配套质控品先进行测定, 在室内质控合格的前提下才能测定待检标本；依据张之南等［4］编著的“血液病诊断、疗效标准”中有关地贫的诊断标准对测定结果进行分析判定。RBC脆性检测使用一管定量筛查法, 操作步骤严格遵照试剂盒说明书进行；如RBC脆性＜70%, 则行地贫基因检测。

1.2.4 HKαα 型基因检测 如果受检者的 MCV＜80 fl、HbA2≤3.5%、RBC脆性＜70%, 且Gap-PCR检测无法确诊则应对其血液标本行进一步的检测；采用巢式PCR对地贫HKαα基因型检测分析。

1.2.5 基因测序 如果受检者的MCV＜80 fl、血红蛋白A2(HbA2)＞3.5%、RBC 脆性 ＜70%, 且 RDB 检测无法确诊则进一步检测其血液标本；利用PCR-SBT技术进行地贫基因测序。

2 结果

2.1 常见基因型结果 在本院筛查的3065例受检者中,519例的筛查试验结果呈阳性, 经常见基因型分析后250例确诊为地贫, 检出率为48.17%(250/519)。确诊患者中α地贫131例(52.40%, 131/250), 其中α地贫2基因型30例(22.90%)、α地贫1基因型89例(67.94%)、HbH病基因型12例(9.16%)。131例α地贫患儿中东南亚缺失型(--SEA/αα)、α地贫2(-α3.7/αα)占 比 高 , 分 别 为 59.54%(78/131)、15.27%(20/131)；αCSα/αCSα、αWSα/αWSα、αQSα/αQSα 基因型及 --SEA/αCSαCS、--SEA/αWSαWS、--SEA/αQSαQS、-α3.7/αQSαQS等HbH病基因型均少见；确诊为αWSα/αCSα罕见突变基因型的1例。确诊为β地贫112例(44.80%, 112/250), 其中β杂合子基因型、β纯合子基因型、β双重杂合子基因型各102例(91.07%)、4例(3.57%)、6 例 (5.36%)；β41-42(-TCTT)/βA、β654(C＞T)/βA检出率较高 , 分别达 33.93%(38/112)、30.36%(34/112)；确诊为β复合α地贫者有7例, 3例(42.86%)为β复合--SEA/αα。

2.2 HKαα基因型结果 检出α地贫罕见基因型2例(0.39%, 2/519), HKαα/--SEA、HKαα/αα 各有 1 例。

2.3 β地贫罕见基因型PCR-SBT测序结果 在检出的3例 β 罕见基因型病例中 , β37(G＞C)、β88-93(-AGTC)、β-88(C＞T)各 有 1例 , 前 者 的 突 变 点 为 405G＞A 或 是413G＞A；后两者的突变点分别于557处有杂合峰、-88处有杂志峰 (C＞T)。

3 讨论

地贫是一种血红蛋白病, 人体在血红蛋白基因缺失或突变的情况下使得α和β珠蛋白肽链合成速率失调, 从而出现溶血性贫血。世界卫生组织(WHO)的数据显示, 全球携带致血红蛋白病基因者达到4.5%, 每年平均有20万以上患有各类地贫的新生儿出生, 地贫对我国的广东、广西等南方地区影响大, 这些省份中有1.2%～8.1%的人群患有重型α地贫［5］。本研究3065例受检者中, 519例的筛查试验结果呈阳性, 经常见基因型分析后250例确诊为地贫, 检出率为48.17%(250/519)。确诊患者中α地贫131例(52.40%, 131/250), 其 中 α 地 贫 2 基 因 型 30 例 (22.90%)、α地贫1基因型89例(67.94%)、HbH病基因型12例(9.16%)。131例α地贫患儿中东南亚缺失型(--SEA/αα)、α 地 贫 2(-α3.7/αα)占 比 高 , 分 别 为 59.54%(78/131)、15.27%(20/131)；αCSα/αCSα、αWSα/αWSα、αQSα/αQSα 基因型及 --SEA/αCSαCS、--SEA/αWSαWS、--SEA/αQSαQS、-α3.7/αQSαQS等HbH病基因型均少见；确诊为αWSα/αCSα罕见突变基因型的1例。确诊为β地贫112例(44.80%, 112/250), 其中β杂合子基因型、β纯合子基因型、β双重杂合子基因型各102例(91.07%)、4例(3.57%)、6 例 (5.36%)；β41-42(-TCTT)/βA、β654(C＞T)/βA检出率较高, 分别达33.93%(38/112)、30.36%(34/112)；确诊为β复合α地贫者有7例, 3例(42.86%)为β复合--SEA/αα。这一结果与贵州、重庆地区有差异, 两地主要类型为β17(A＞T)。表明深圳作为外来人口较多的城市, 其地贫基因型的分布特点独特。利用巢式PCR技术检出HKαα的确诊率为0.39%(2/519), 比广西地区的0.07%高, 这可能与深圳特有的分布构成有关, 这提示在临床工作中应综合分析可疑病例的检测结果, 减少误诊、漏诊的发生。本研究应用RDB技术对已知位点突变的基因型进行检测, 如果突变点未知则应运用PCR-SBT法, 此法能够对碱基突变点进行直接检测。本研究通过PCR-SBT法检出新的碱基突变点, 发现β37(G＞C)、β88-93(-AGTC)、β-88(C＞T)3 个罕见基因型 ,地贫确诊率为0.58%(3/519)。但是总结临床实践经验与理论知识发现, 在基因序列分析中应对碱基突变点给予更多关注,以免因碱基插入形成连续套峰而误认为其为PCR-SBT扩增不成功所致, 加大误诊、漏诊率。

综上所述, 临床应充分利用常规筛查试验、借助RDB、Gap-PCR、SBT、巢式PCR技术对地中海贫血患儿进行基因检测, 并对结果进行综合分析, 旨在为婚前、孕前、孕期地贫的筛查与基因诊断提供参考。