龙眼核多酚提取工艺优化及降胆固醇作用

李 妍， 曾亚丽， 曹珂珂， 黄世瑜， 王 娣

龙眼（Dimocarpus longan Lour.）是属于无患子科龙眼属植物，是一种典型的亚热带果树[1]，其果实俗称桂圆.近年来，相关研究表明，龙眼核多酚具有良好的抗氧化、抑菌及降血糖等生物活性[2]，并且在防治心血管疾病、降低胆固醇等方面也具有一定的作用[3].当前对龙眼核的研究重点仅着重于对龙眼淀粉、棕色素、多糖的提取测定及研究等方面，而关于龙眼核多酚的研究相对不足[4].通过大量研究结果证实，多酚多种生物活性表现在抗癌、抗菌、抗氧化和预防心脑血管疾病等方面[5].本文把龙眼核作为原料，对其中的多酚类化合物采用微波辅助萃取法提取，通过单因素实验，运用响应面设计构建关于多酚的提取率和提取条件的数学模型，由此得出优化的提取工艺条件并测试其体外降血脂作用，以便进一步龙眼核的利用率，为龙眼核进一步深加工做准备[6-10].

1 实验材料与设备

1.1 材料与试剂

龙眼（品种灵龙，产地广西灵山县），龙眼核干燥粉碎过60目筛密闭保存于棕色瓶中.

胆固醇（国药集团化学试剂有限公司）；没食子酸（天津市永大化学试剂有限公司）；钨酸钠（国药集团化学试剂有限公司）；钼酸钠（无锡市亚泰联合化工有限公司）；硫酸锂（天津博迪化工股份有限公司）；石油醚（天津市永大化学试剂有限公司）；液溴（天津市大茂化学试剂）.

1.2 仪器

电热鼓风干燥箱（上海-恒科学仪器有限公司）；XFB-200高速中药粉碎机（吉首市中诚制药机械厂）；电子天平AB323（上海海康电子仪器厂）；JK-800DB型数控超声清洗器（合肥金尼克机械制造有限公司）；数显恒温水浴锅HH-1（金坛市杰瑞尔电器有限公司）；TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）.

2 实验方法

2.1 试验流程

龙眼核烘干、粉碎→提取→抽滤→处理滤液→测吸光度→计算提取率

2.2 没食子酸标准曲线

准确称取100 mg的没食子酸，溶解于1 000 mL的容量瓶中，定容，摇匀，得到标准液浓度为0.1 mg/mL.再分别吸取上述没食子酸标准液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于25 mL的棕色容量瓶中.分别加入FC试剂，摇匀.在0.5-8 min内，加入10%Na2CO312 mL，充分混合后，蒸馏水定容.室温下避光放置2 h.在765 nm波长下测吸光度[11].每个样品设置三次重复实验，取其平均值.把没食子酸溶液的浓度作为横坐标，把所测的吸光度作为纵坐标，作标准曲线，可以得到线性回归方程：y=0.10397x-0.00838，R2=0.9958.

2.3 计算公式

式中：C为样品的浓度（根据标准曲线算出），mg/mL；

V为样品稀释后的体积，mL；

n为稀释的倍数；

m为粗提取物质量，mg.

式中：A0为空白溶液胆固醇浓度，mg/mL；

A1为样品溶液胆固醇浓度，mg/mL.

2.4 微波辅助提取龙眼核多酚的单因素试验

2.4.1 料液比对提取率的影响

称取2 g的龙眼核粉，取80%的乙醇浓度，时间3 min，分别在料液比 1：20、1：30、1：40、1：50、1：60 条件下提取，再按“2.2”项测定其吸光度，三次平行，提取率可根据标准曲线方程和提取率的计算公式算出.

2.4.2 时间对提取率的影响

称取2 g的龙眼核粉，取80%的乙醇浓度，1：50的料液比，分别在提取时间为 1、2、3、4、5 min条件下提取，按“2.2”项测定吸光度，三次平行，提取率可根据标准曲线方程和提取率的计算公式算出.

2.4.3 乙醇浓度对提取率的影响

称取2 g龙眼核粉，料液比1：30，乙醇浓度40%、50%、60%、70%、80%下提取 4 min，按“2.2”项测定吸光度，三次平行，提取率可根据标准曲线方程和提取率的计算公式算出.

2.5 响应面优化提取条件

料液比、提取时间和乙醇浓度三个因素分别对提取率的影响可通过单因素实验的结果看出.从每个因素中选取三个水平，通过Box-Benhnken设计，目标为龙眼核多酚的提取率，实验变量取料液比、提取时间、乙醇浓度三个因素，在此之上做响应面实验，得到优化的提取条件.实验因素水平编码表如下表1.

表1 分析因子与水平编码

2.6 验证试验

从响应面法实验中分析得到的结果，由此确定最佳提取条件.为与预测值进行比较，需在最佳的提取条件下做三组平行实验，计算出各组提取率，取其平均值.

2.7 降胆固醇试验

2.7.1 胆固醇标准曲线

胆固醇标准曲线绘制相关文献方法进行，略有改动[12].具体方法为：准确吸取胆固醇工作液0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL分别置于10 mL试管内，加入冰乙酸，定容到4 mL，之后沿管壁加2 mL铁矾显色液，混匀，在15-90 min内，560 nm下测吸光度.每组平行三次，取其平均值.横坐标为胆固醇溶液浓度，纵坐标为吸光度，作标准曲线，得到线性回归方程：y=0.00979x-0.001，R2=0.9984.

2.7.2 降胆固醇试验

采用实验得出的最佳提取条件提取龙眼核多酚，分别吸取1 mL不同浓度的龙眼核多酚溶液于10 mL试管内，再依次加入（1 mL 100μg/mL胆固醇溶液+3 mL冰乙酸+2 mL铁矾显色液），测定吸光度，计算不同时间溶液中胆固醇的清除率[13-15].

3 结果与分析

3.1 单因素试验结果

3.1.1 提取时间对龙眼核多酚的影响

在料液比为1：50，乙醇浓度为80%的微波提取条件下，得到龙眼核多酚提取率随时间长短变化如图1所示，在提取时间4 min之前提取率随着时间增大而增大，之后提取率开始下降，因此在提取时间中选择3、4、5 min三个水平.

3.1.2 料液比对龙眼核多酚的影响

微波提取条件为乙醇浓度80%，时间3 min，得出龙眼核多酚提取率随不同料液比的变化如图2所示，龙眼核多酚提取率在料液比1：40之前呈上升趋势，随后下降.因此，在料液比选择 1：30、1：40、1：50 三个水平.3.1.3 乙醇浓度对龙眼核多酚的影响

图1 提取时间对龙眼核多酚的影响

图2 料液比对龙眼核多酚的影响

微波提取条件为时间3 min，料液比1：40，得出龙眼核多酚提取率随不同乙醇浓度变化如图3所示，龙眼核多酚提取率先一直呈上升趋势，之后逐渐趋于变缓.因此，在乙醇浓度上选择60%、70%、80%三个水平.

图3 乙醇浓度对龙眼核多酚的影响

3.2 响应面法设计及结果

3.2.1 响应值结果及其拟合模型

采用Box-Behnken设计实验方案得到实验设计及结果如下表2所示.

通过Design-expert试验设计，把料液比、提取时间、乙醇浓度作为响应变量，提取率作为响应值，对表2进行回归拟合的分析后得到拟合方程如下：Y=5.50+0.67A+0.30B+0.21C-0.073AB-0.074AC+0.044BC-0.34A2-0.43 B2-0.34C2试验方差分析如下表3所示.

由表3显示，模型的F值为18.53，得出因变量与自变量之间的线性关系较明显，模型的失拟项不显著，说明模型与试验的拟合情况良好.之后用Box-Behnken继续分析并结合实际操作得到料液比1：40，乙醇浓度65%，提取时间3 min为最佳提取条件，得出龙眼核多酚预测提取率为6.09%.

表2 试验设计及结果

表3 回归模型方差分析

3.2.2 等高线图和响应曲面图分析

当3min作为提取时间固定时，通过图4并结合上面的分析得出的最佳条件可以发现，料液比在1：30-1：37.53，乙醇浓度在60%-68.61%所形成的区域内，随着乙醇浓度的增大和料液比的升高提取率有所增加，但增幅趋势有所减缓，当乙醇浓度升到68.61%，料液比升至1：37.53 时，达到最大.

图4 乙醇浓度和料液比对龙眼核多酚的影响

图5 时间和乙醇浓度对龙眼核多酚的影响

图6 料液比和时间对龙眼核多酚的影响

当料液比1：40固定时，由图5并结合上述分析最佳条件可以看出，时间在2-2.76 min，乙醇浓度由60%-68.61%所形成的区域内，随着乙醇浓度的增大和时间的增长，提取率一直增大，增幅趋势逐渐减缓，当时间达到2.76 min，乙醇浓度增至68.61%时，达到最大.

当固定乙醇浓度为70%时，由图6并结合上述分析最佳条件可发现，在提取时间为2-2.76 min，料液比为1：30-1：37.53所形成的区域内，随着时间和料液比的增大，提取率不断增长，但是增幅趋势有所减缓；当时间增至2.76 min，料液比升至1：37.53时，达到最大.

3.3 验证实验

把响应面法分析得出的龙眼核多酚提取工艺的最佳提取条件，与实际可操作条件结合，选取料液比为1：40，乙醇浓度为65%，提取时间为3 min条件进行三次平行试验，实验结果见表4.所选条件比预测条件稍低，得出实际提取率比预测值也稍低，相对误差4.92%.

表4 验证实验结果

3.4 降胆固醇试验

图7 不同浓度随时间对清除率的影响

由图7可知，随着浓度的增加，龙眼核多酚对于胆固醇的清除率升高，但实验表明：随着时间的增大，多酚中含有多羟基易被氧化，使得其胆固醇清除率缓慢降低.

4 结论与讨论

本研究以时间、乙醇浓度、料液比作为单因素，选定微波辅助萃取法，根据实验设计得出不同的料液比、时间、乙醇浓度均对龙眼核多酚的提取率有影响，其中乙醇浓度的影响最为显著.之后再通过三因素三水平的响应面实验设计得到时间2.76 min，料液比1：37.53，乙醇浓度68.61%为最佳微波辅助龙眼核多酚提取工艺的条件，在此条件下，预测提取率为6.09%.为便于实际操作，提取时间3 min，乙醇浓度65%，料液比1：40的条件进行实验，得到提取均值5.79%，比预测值稍低，其相对误差为4.92%.通过响应面设计龙眼核多酚的提取实验能够提高龙眼核多酚的提取率，同时也为龙眼的废料加以回收利用提供了新思路.

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